花藥培養與分子標記輔助選擇相結合快速選育抗條紋葉枯病晚粳稻新品系的技術探討

于鳳池，姚 堅，姚海根，殷躍軍

(浙江省嘉興市農業科學研究院，浙江 嘉興 314016)

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱為傳毒媒介的病毒病，近年來，水稻條紋葉枯病在浙江省北部晚粳稻區呈快速上升趨勢，對水稻安全生產構成了很大威脅［1］。花藥培養在水稻育種上的應用始于20世紀70年代后期，由于它具有縮短育種年限、擴大變異范圍等優點，在新品種培育、雜交水稻提純復壯、新種質創制等方面得到了廣泛應用［2－3］。分子標記輔助選擇技術具有準確率高、不受生育期限制等優點，近年來在水稻育種中的應用越來越廣泛，尤其在水稻抗性育種方面應用效果頗佳［4］。本研究結合花藥培養和分子標記輔助選擇技術，將抗條紋葉枯病主效基因和微效多基因快速聚合到晚粳稻品種中，以提高晚粳稻品種的條紋葉枯病的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

受體親本:秀水09、秀水128、中間材料秀水132/GP15//丙05111等;抗條紋葉枯病供體親本:鎮稻 631、鎮稻 413、秀水 114和中間材料丙00502/秀水123等。

1.2 條紋葉枯病田間抗性鑒定方法

采用大田自然發病鑒定。在條紋葉枯病重病區建立鑒定圃，鑒定圃不防治灰飛虱，于5月中旬播種，單本插，每份材料種植100株左右，8月底調查株發病率。

1.3 DNA提取及PCR技術

用于DNA提取的材料為大田水稻抗條紋葉枯病組合F1植株和花培后代苗期取回的嫩葉片。用于PCR反應的引物為 F-5′TAGCCATGCTCATGCGTCAT 3′;R-5′CGCGGTTTGCAGTAGTTGC 3′。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增反應總體積為 20 μL，其 中 包 括 10 × PCR buffer 2 μL，MgCl22 μL，dNTP 200 μmol·L－1，引物 F，R 各50 ng，基因組 DNA 1μL(約50 ng) 和1 U的 Taq DNA聚合酶。擴增程序如下:下預變性2 min，94℃下變性45 s，58℃下退火45 s，72℃下延伸1 min，35次循環，最后72℃下延伸5 min。

1.4 花藥培養技術

經PCR檢測含有抗條紋葉枯病基因的單株，在花藥處于單核靠邊期取樣，采用一步成苗法進行花藥培養。培養基基本成分為:N6大量和 MS微量，添加一定濃度的 NAA、2，4-D、甘氨酸、KT等，以及0.7%瓊脂，5%蔗糖，pH值5.8。花藥經過30～40 d的 (26±1)℃暗培養后，轉入光照下 (每天12 h)進行分化培養，將分化出的綠苗轉移到無激素和低糖濃度的壯苗培養基上進行壯苗培養后，移栽于大田。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

采用以上引物和反應程序進行PCR反應，并用3%的瓊脂糖凝膠電泳，其中高抗對照品種為丙00-502，中抗品種為 XR278，高感品種為秀水09。根據電泳條帶判斷樣品的抗感性，并結合田間抗性鑒定結果進行最終篩選。2008年秋對29個抗條紋葉枯病組合共計218個花培取樣的F1植株檢測，其中35個植株不含抗條紋葉枯病基因。

2.2 花藥培養

分蘗期于含有抗條紋葉枯病基因的組合F1植株逐株取嫩葉作分子標記檢測，淘汰不抗條紋葉枯病組合及植株。于抗條植株花藥處于單核靠邊期時取樣接種。2007年春至2008年春3批接種培養晚粳稻組合共計69個，獲得綠苗10 269株;嘉興正季兩年共獲得花培鑒定株系363份。

3 抗條紋葉枯病晚粳稻新品系的選育

通過對不同組合花藥培養后代材料進行條紋葉枯病分子標記檢測、小區產量、農藝性狀、品質及其它抗性鑒定，并在重病區進行條紋葉枯病自然發病鑒定。2007、2008年分別篩選到3份對條紋葉枯病抗性較好、其它綜合性狀良好的晚粳稻新品系，其中07HK23、08HK80參加了2008年浙江省晚粳育種攻關組聯合品比，07HK75參加了2008年浙江省特早熟晚粳稻區試，其主要特征如表1所示。

表1 抗條紋葉枯病早熟晚粳稻的主要特征

4 抗條紋葉枯病常規晚粳稻新品種的高效快速選育程序

基于2年的育種實踐，我們認為花藥培養取樣前，先對取樣植株進行抗條紋葉枯病分子標記輔助選擇，可以淘汰不含目標基因的組合和植株 (假雜種)，減少花藥培養的工作量，使花培效率大大提高。對花藥培養后代材料苗期進行抗條紋葉枯病分子標記檢測可以達到早期選擇的目的，縮小產量鑒定圃的規模，同時減輕其他鑒定的工作量，提高整個選育工作的效率。因此，我們建立了以下采用花藥培養與分子標記輔助選擇相結合選育抗條紋葉枯病晚粳稻新品種的程序 (圖1)。

5 小結與討論

圖1 抗條紋葉枯病晚粳新品種的選育程序

雖然水稻花藥培養已成為水稻育種的成熟手段，但仍存在不少技術難題與理論問題，其中最主要的問題是花藥培養綠苗率低，白化苗較多，尤其是秈稻的綠苗率只有1.0% ～1.5%［5］;相比之下，粳稻綠苗率較高，一般可比秈稻高5～10倍，但不同親本所配組合間差異很大。在本研究中，2007年上半年28個組合F1花培綠苗率平均為37.13%，變幅在4.84%～79.23%之間 (按管計算);全年2季42個粳稻組合共接種花藥約14 000管，出愈率在75%左右 (按管計算);綠苗率在25%左右(按管計算)。

綠苗率的高低直接影響了花培育種的效率，而影響花藥培養效率的因素是多方面的，既有內在因素 (材料的基因型)，也有外在因素 (外植體的發育程度、取材時期、培養基的組分、培養條件等)［6］。因此，在開展水稻花藥培養育種時，首先需要解決花培的誘導頻率，選擇適宜培養的優良組合;探索和研究外植體的合適取材時期;選擇最適的培養基組分，以及最合理的誘導和分化的培養環境。

分子標記輔助選擇與花藥培養相結合，應用于抗條紋葉枯病晚粳稻新品種的選育，提高了育種速度，縮短了育種年限，在本研究中從配組到獲得穩定的抗條紋葉枯病新品系只化了2年時間 (每年嘉興、海南2代)，可比常規育種縮短2年左右。隨著現代生物技術的迅速發展，新型的分子標記不斷涌現，花藥培養力不斷提高，該途徑可望在其他的水稻育種實踐中得到更廣泛的應用。

［1］張國鳴，王華弟，戴德江.浙江省水稻條紋葉枯病發生發展態勢與防控對策措施 ［J］.中國植保導刊，2006，26(7):20－21.

［2］倪丕沖.我國水稻花培育種及其應用 ［J］.農業科技通訊，1991，(5):5－6.

［3］李梅芳.水稻花培育種前景 ［J］.作物雜志，1991，(3):17－18.

［4］沈圣泉，舒慶堯，吳殿星，等.利用分子標記輔助選擇育成抗螟蟲秈稻不育系科龍 A［J］.雜交水稻，2008，23(2):15－18.

［5］柳美南，鐘海明，陳綿橋，等.水稻花藥培養及其應用［J］.現代農業科技，2008，(17):234－236.

［6］王興春，楊長登，李西明，等.分子標記輔助選擇與花藥培養相結合快速聚合水稻白葉枯病抗性基因 ［J］.中國水稻科學，2004，18(1):7－10.