雙氯芬酸鈉乳膏的微生物限度檢查方法驗證試驗研究

鄭 笠，林小毅

（福建省福州市藥品檢驗所，福建福州 350007）

雙氯芬酸鈉乳膏為乳劑型基質(zhì)的類白色乳膏，在建立雙氯芬酸鈉乳膏的微生物限度檢查方法時應(yīng)進行方法驗證，選擇正確的方法降低或消除該藥品抑菌作用對試驗的干擾，以證明所采用的方法適合于該藥品細菌、霉菌和酵母菌數(shù)的測定及控制菌的檢查。因此，筆者采用《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法項下方法建立傷痛寧膏的細菌、霉菌和酵母菌及控制菌的檢查方法并驗證。

1 儀器與試藥

1.1 試驗環(huán)境

在環(huán)境潔凈度萬級、局部潔凈度百級的單向流空氣的無菌室中進行。

1.2 樣品

雙氯芬酸鈉乳膏由福州某藥業(yè)有限公司提供。

1.3 驗證菌種

枯草桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、銅綠假單胞菌[CMCC （B）10104]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 稀釋液

pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：091217，福州市藥品檢驗所菌檢室）。

1.5 儀器

SW-GJ-1BU標準型潔凈工作臺、YXQ-LS-50S數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器、SHP-250生化培養(yǎng)箱、MJX-250BZ霉菌培養(yǎng)箱。

1.6 培養(yǎng)基

干粉：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：080304），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：081217），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：081119），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：081210），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：080628），溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號：091107），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：081031），改良馬丁培養(yǎng)基（批號：090307）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物1 ml加9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液逐管 10 倍稀釋至 10-5～10-7，為 50～100 cfu/ml，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)48～72 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 ml加9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液逐管10倍稀釋至10-5～10-7，為50～100 cfu/ml，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1 ml加9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液逐管10倍稀釋為10-4，為50～100 cfu/ml，備用。

2.2 供試品溶液制備

取本品5 g，與5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯、5 g聚山梨酯80混合于無菌燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃的pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1∶20供試品溶液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌檢查法的驗證

2.3.1 常規(guī)法 采用常規(guī)法進行3次獨立的平行實驗，每種菌液做平行2皿。

2.3.2 菌液組 分別取枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌3種菌液各1 ml，注入培養(yǎng)皿中，然后注入45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約 15 ml，待凝固后，置 30～35℃培養(yǎng) 24～48 h，逐日觀察結(jié)果。分別取白色念珠菌、黑曲霉2種菌液各1 ml，注入培養(yǎng)皿中，然后注入45℃改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基約15 ml，待凝固后，置 23～28℃培養(yǎng) 48～72 h，逐日觀察結(jié)果。

2.3.3 供試品對照組 取本品1∶20供試品溶液1 ml，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，逐日觀察結(jié)果，測定供試品本底菌數(shù)。

2.3.4 試驗組 取本品 1∶20供試品溶液 1 ml、50～100 cfu/ml試驗菌液1 ml，分別注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，逐日觀察結(jié)果。

2.3.5 稀釋劑對照組 取稀釋劑1 ml、50～100 cfu/ml試驗菌液1 ml，分別加入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，逐日觀察結(jié)果。

2.3.6 實驗結(jié)果 見表1。由表1可知，經(jīng)3次平行試驗，結(jié)果試驗組及稀釋劑對照組的5種陽性試驗菌株的回收率均大于70%，因此可采用常規(guī)法測定該供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。

表1 細菌、霉菌和酵母菌常規(guī)法平皿計數(shù)方法的驗證

2.4 控制菌檢查方法驗證

2.4.1 試驗組 取1∶20的供試品溶液 20 ml及 10～100 cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查。

2.4.2 陰性菌對照組 取1∶20的供試品溶液20 ml及10～100 cfu的陰性對照菌，加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對照菌不得檢出。

2.4.3 陽性對照組 取10～100 cfu的陽性對照菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。

2.4.4 陰性對照組 取稀釋劑20 ml加入控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長。

2.4.5 本底對照組 取1∶20的供試液20 ml加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。

2.4.6 實驗結(jié)果 見表2、3。

表2 金黃色葡萄球菌驗證試驗結(jié)果

表3 銅綠假單胞菌驗證試驗結(jié)果

由表2驗證試驗可知，金黃色葡萄球菌（試驗組100 ml、200 ml營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂平板均未檢出，營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基至300 ml經(jīng)培養(yǎng)后劃平板檢出），因此采用培養(yǎng)基稀釋法依法檢查。表3驗證試驗結(jié)果可知，銅綠假單胞菌各組生長良好，陰性菌無生長，可采用常規(guī)法檢查。

3 討論

由試驗結(jié)果可以看出，試驗組及稀釋劑對照組的試驗菌株的回收率均大于70%，因此可采用常規(guī)法測定該供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。控制菌金黃色葡萄球菌應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法檢查、銅綠假單胞菌采用常規(guī)法依法檢查。

稀釋劑對照組用以評價供試品溶液制備方法對微生物的影響，本次試驗稀釋劑對照組的回收率均大于70%，說明采用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液對試驗不產(chǎn)生干擾。

精確測定菌數(shù)是回收率測定最為關(guān)鍵的步驟，為減少操作誤差，一般應(yīng)取每毫升含菌 50～100 cfu的菌液1 ml進行驗證實驗。

驗證試驗進行3次獨立平行試驗，傾注培養(yǎng)基時每次試驗各平皿所加的培養(yǎng)基體積應(yīng)盡量保持一致，注入后快速轉(zhuǎn)動平皿使供試品溶液與培養(yǎng)基混勻，以使回收試驗結(jié)果重現(xiàn)性良好。

雙氯芬酸鈉乳膏為非水溶性供試品，為使其充分乳化溶解，先將供試品5 g置無菌燒杯中，再加入適量的單硬脂酸甘油酯、司盤80，聚山梨酯80用無菌玻棒攪拌有利于分散均勻，再慢慢加入45℃的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，邊加邊攪拌，使其成為均勻的乳液。

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