嗅鞘細胞移植到損傷脊髓存活時間的研究

陳莉發,段朝霞,張潔元,李兵倉,余華榮

(1.重慶醫科大學基礎醫學院生理教研室,重慶 400016;2.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所第六研究室,創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一種特殊的膠質細胞,能促進嗅神經再生,引導無髓鞘嗅神經軸突從外周嗅粘膜上皮出發,穿過篩板,進入嗅球,使嗅神經終身具有再生性[1]。OECs分泌許多神經營養因子[2,3],如神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質細胞源性神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF),神經營養因-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)和神經調節蛋白(neuregulin,NRG)。OECs獨特的生物學特性引起了眾多學者的興趣,目前,對OECs移植修復作用的研究頗多,但對其移植后存活的研究報道較少,或者結論不統一。本研究以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)轉基因大鼠為供體,觀察其嗅球OECs植入挫傷脊髓后的存活情況,從而為其在移植修復中的作用提供細胞學參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2.5月齡清潔級GFP轉基因大鼠,體重(220±15)g.2.5月齡清潔級普通SD大鼠,體重(220±15)g(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供)。所有動物的飼養和處理均按第三軍醫大學動物管理委員會的規定進行。

1.1.2 主要儀器設備、試劑 DMEM/F12培養基(GIBCO,美國);胎牛血清(FCS,GIBCO,美國);Forskolin(INVITROGEN,美國);堿性成纖維生長因子(bFGF,INVITROGEN,美國);多聚左旋賴氨酸(poly-l-lysine,SIGMA,美國);胰蛋白酶(GIBCO,美國);小鼠抗大鼠S100蛋白抗體(S100,武漢博士德);兔抗神經生長因子受體多克隆抗體(NGFR p75,武漢博士德);TRITC標記的山羊抗兔IgG(武漢博士德);FITC標記的山羊抗小鼠IgG(武漢博士德);Hoechst33342(SIGM A,美國)。NYU撞擊機(美國);立體定位儀(ST-7,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 OECs的原代培養 3%戊巴比妥鈉致死劑量(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,斷頭,消毒后無菌環境下迅速取出GFP轉基因大鼠雙側完整嗅球。剪去嗅球尾側1/3,取頭側2/3置于4℃預冷的D-Hanks液中(青、鏈霉素各100 U/L)。用顯微外科器械在解剖顯微鏡下仔細剝除包被嗅球的軟腦膜及附著的毛細血管,沿縱軸方向剖開嗅球,剝除嗅球內部的白質層,將分離得到的外部灰質層,即嗅球纖維層和嗅小球層,用眼科彎剪剪碎至1 mm大小組織塊,0.125%胰蛋白酶37℃消化20 min.巴氏滴管小心吸取消化后的組織塊,移至加有3 ml DFF20(DMEM/F12/20%FCS)全培養液的培養皿中終止消化,5 min后,移至加有3 ml DFF20全培養液的離心管內,用經火焰拋光的巴氏滴管吹打15-20次,使組織塊分散成單細胞懸液,靜置5 min后收集上層細胞懸液。接種于包被多聚左旋賴氨酸(10 μ g/ml)的 6孔培養板內,置于37℃、5%CO2孵箱中培養。培養3 d后,用添加有Forskolin(100 mg/l)和bFGF(0.01 mg/l)的DFF20全培養液半量換液一次,以后每2-3天全量換液 1次。培養第10天,植入損傷脊髓。

1.2.2 GFP-OECs移植

制備GFP-OECs懸液:用酶消化法將培養10 d的 GFPOECs制成單細胞懸液,細胞濃度為 3×105個/μ l.

建立脊髓T10挫傷模型:取SD大鼠,3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手術臺,備皮,碘伏消毒皮膚,酒精脫碘,鋪無菌巾,無菌條件下暴露脊髓T10節段,置于NYU撞擊機固定,以10g、25mm致傷力挫傷脊髓。

移植GFP-OECs:將脊髓挫傷后的SD大鼠置于立體定位儀固定,用玻璃微電極吸取細胞懸液,注入損傷部位及其首尾側各 1 mm 處,每處注射 1 μ l,共計 3 μ l,注射深度 1 mm,留針 1 min,隨后縫合肌肉、皮膚各層,移植術后將動物分為兩組:環孢菌素A組,移植術后每天腹腔注射環孢菌素A(cyclosporin,CsA)(10 mg/kg);非環孢菌素A組,術后未注射環孢菌素A.動物術后均與揉壓排尿和抗感染護理,兩組動物于移植術后1、2、4、8周麻醉后開胸暴露心臟,經主動脈灌注生理鹽水200 ml,4%多聚甲醛400 ml,取出移植部位脊髓置相同固定液繼續固定2 h,制作15μ m厚冰凍切片,于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP-OECs.

2 結果

2.1 非環孢菌素A組

此組動物移植術后 1、2周取材,制成冰凍切片,于熒光顯微鏡下損傷的脊髓處可見自發綠色熒光的OECs(圖1A、B),移植術后4周,損傷的脊髓處未見綠色的OECs(圖1C)。

2.2 環孢菌素A組

此組動物移植術后1周、2周、4周取材,制成冰凍切片,于熒光顯微鏡下損傷的脊髓處可見自發綠色熒光的OECs(圖2A-C),移植術后8周,損傷的脊髓處未見綠色的OECs(圖2D)。

3 討論

GFP作為標記物,被廣泛應用于細胞移植的研究領域,GFP轉基因動物分離得到的細胞標記穩定,且不影響或很少影響細胞的正常功能,是細胞移植研究最為理想的工具[4]。本實驗從GFP轉基因動物分離得到自發綠色熒光的嗅鞘細胞,存活的嗅鞘細胞在藍色熒光下呈肉眼可見的綠色,具有觀察簡單、避免假陽性等優點。

移植物存活時間一方面取決于移植物本身,另一方面取決于移植排斥反應的強弱。引起移植排斥反應的抗原稱為移植抗原或組織相容性抗原,能引起強烈排斥反應的抗原稱為主要組織相容性抗原(MHC抗原),供、受者間M HC型別差異是發生急性排斥反應的主要原因[5]。OECs高表達M HC-Ⅰ分子,中等表達MHC-Ⅱ分子[6],M HC分子與抗原肽形成抗原肽/MHC分子復合物供T細胞識別,活化的T細胞可直接殺傷表達異型抗原的移植物細胞,環孢菌素A是一種不溶性的真菌代謝產物,含有11個氨基酸的環狀多肽,能有效地抑制T細胞介導的細胞免疫反應,使T細胞的擴增和分化受阻,環孢菌素A是一種抗有絲分裂和抗炎雙重效應的高效免疫抑制劑。急性排斥反應一般在移植術后數天至2周左右出現,本實驗未注射環孢菌素A組細胞存活時間只有2周,注射環孢菌素A組細胞移植后4周仍存活,說明OECs移植到脊髓存在排斥反應,而細胞移植后8周,未見綠色熒光的 OECs,說明 GFP-OECs死亡,不能表達綠色熒光蛋白。因此,OECs存活時間大于4周但小于8周,OECs移植后不能長期存活,避免給機體帶來不良后果,比如“異位”占位,腫瘤等。

[1]Ramón-Cueto A,Avila J.Olfactory ensheathing glia:properties and function[J].Brain Res Bull,1998,46(3):175-187.

[2]Woodhall E,West AK,Chuah MI.Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor,brain-derived neurotrophic factor,glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(1-2):203-213.

[3]Lipson AC,Widenfalk J,Lindqvist E,et al.Neurotrophic properties of olfactory ensheathing glia[J].Exp Neurol,2003,180(2):167-171.

[4]Mothe AJ,Kulbatski I,van Bendegem RL,et al.Analysis of g reen fluorescent protein ex pression in transgenic rats for tracking transplanted neural stem/progenitor cells[J].J Histochem Cytochem,2005,53(10):1215-1226.

[5]龔非力.醫學免疫學[M].第2版.北京:科學出版社,2004.

[6]梅愛農,朱鵬立,楊津,等.大鼠嗅鞘細胞免疫抗原分子檢測[J].神經病與精神病學,2010,5(1):35-38.