脫細胞骨基質對骨髓間充質干細胞成骨及示蹤的觀察

孫新君,王正國,張波,朱佩芳,劉光軍,劉勇

(1.中國人民解放軍第89醫院全軍創傷骨科研究所 山東 濰坊 261045;2.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所 重慶 400042)

MSCs是存在于骨髓環境中除造血干細胞外且有多向分化潛能的干細胞。因其取材方便、自體細胞移植不存在排斥反應以及易于外源基因的導入和表達,作為骨組織工程種子細胞的研究和應用日益增多[1,2]。組織工程骨體內修復的關鍵是種子細胞在體內是否發揮作用,植入體內后的結局如何等尚需要進一步觀察。然而,要在體評價細胞與材料復合后的遷移、定位等十分困難,尤其是在局部微環境誘導分化后細胞與宿主骨髓源細胞或骨膜來源的骨形成細胞難以區分,從而難以正確評價MSCs的修復功能。本實驗利用綠色熒光蛋白小鼠MSCs進行在體示蹤,從而觀測MSCs在骨形成局部的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 表達綠色熒光蛋白小鼠 5只(鼠齡4周),雌雄不限,體重約20±2 g,由昆明醫學院神經科學研究所提供;Balb/c裸鼠15只,雌雄不限,鼠齡5-6周,體重15-20 g,由中國科學院上海藥物研究所動物中心提供。

1.1.2 細胞培養 Percoll分離液(Pharmarcia),低糖DMEM 培養液、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清(Hyclone產品),胰蛋白酶(Gibco)。

1.1.3 生物材料 選用豬松質骨脫細胞骨基質材料,其制備方法參照文獻[3]。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的培養 由GFP小鼠股骨和脛骨抽出大約0.5 ml骨髓,用含10%FCS的DMEM 培養基稀釋成3 ml,將細胞懸液沿管壁緩慢加入含5ml Percoll(密度1.073×10-3g/L)的離心管中,DMEM培養基洗滌一次后,進行梯度離心,2000 r/min離心20 min,小心吸取中間交界面的單核細胞層,加入完全培養基(DMEM+10%FCS+青霉素100 U/ml-鏈霉素100 mg/L),將細胞以2×105cm2接種于25ml培養瓶。72h后首次換液去除未貼壁細胞,此后每3 d換液1次。大約12 d后細胞基本融合,應用T rypsin-EDTA消化細胞,制成單細胞懸液后以1.0×104/cm2密度接種傳代。熒光顯微鏡下觀察細胞GFP表達。

1.2.2 細胞的種植 首先將大小2×2×2 mm的ACBM在DMEM 培養基中預濕,然后將1.0×106個MSC(第三代)制成100 ul細胞懸液,利用微量注射器加入基質材料上,并盡量使細胞灌入孔隙中;在24孔板靜置培養,37℃、5%CO2孵箱培養4 h后加入完全培養基覆蓋基質材料,培養24 h.

1.2.3 模型制作方法 無菌條件下,以0.1 ml/kg(BW)的速眠新麻醉后,碘伏消毒,鋪巾,在髂后上棘處作5 mm長的切口,切開皮膚、筋膜,鈍性分離肌肉,制作肌袋模型,將單純 ACBM 和種植了MSCs的ACBM 分別植入裸鼠肌袋內(15只,分別稱為實驗側和對照側)逐層縫合切口。術后將裸鼠無菌環境下分籠飼養,定期觀察、檢測。1.2.4 檢測方法

細胞粘附:于MSCs種植于材料后6 h、24 h,隨機抽取4個標本,倒置顯微鏡下觀察MSC附著及生長;培養24 h后將材料用戊二醛固定后剖開,取中央部分制作掃描電境標本,觀察種植后細胞在材料內表面粘附伸展。

大體觀察:術后裸鼠的飲食、活動及傷口情況,4-12周植入材料取出時的大體觀察。

X線及組織學:分別于材料植入后4、8、12周隨機抽取5只動物進行X平片檢查,然后將植入材料及毗鄰組織取出后,制作冰凍切片直接在熒光顯微鏡下觀察種植MSCs的定位及GFP的表達;同時將相連續的層面制作石蠟切片,行HE染色,觀察新骨形成情況。

2 結果

2.1 MSCs的分離、培養及粘附

原代細胞主要以克隆集落方式生長,細胞基本上為紡錘形的成纖維細胞形態。細胞傳代后,呈均勻分布的紡錘形細胞生長。熒光顯微鏡下觀察,原代及傳代MSCs均表達GFP。MSCs種植于材料后6 h,倒置顯微鏡下可見材料表面MSCs開始伸展(圖1a);隨后,細胞密度隨培養時間延長逐漸增多;SEM觀察見種植后6 h,細胞在材料內表面粘附伸展;培養24 h,細胞間出現連接(圖1b)。

2.2 大體觀察

術后動物存活良好,未見植骨處紅腫、滲液及感染,切口2 w愈合。裸鼠體內GFP小鼠MSCs-材料植入后8 w,皮下可觸及質硬的包塊;12 w,形成明顯的皮下結節,裸鼠植入松質骨側4w,X線照片顯示植入材料部分吸收;12周,松質骨材料被吸收,X線平片觀察,與周圍組織無明顯差別。而GFP鼠MSCs-復合材料植入側,4-12 w,局部骨痂密度逐漸加強,面積逐漸變大(圖2a)。解剖見實驗側新生骨組織成團塊狀凸出至皮下,周圍有豐富的血管(圖2b)。

2.3 組織學觀察

HE染色可見實驗側以移植物為中心有大量軟骨以及少量新骨生成,材料逐漸降解,并有血管、肌肉、纖維組織長入材料間隙中,未發現明顯的炎癥反應;在移植物中央新骨形成較少,髓腔內有小梁骨形成。

植入GFP小鼠MSCs-材料復合物側,4w時熒光顯微鏡下見局部有較強的熒光物質聚集,結合HE染色判斷,熒光物質主要集中在新生軟骨基質中;8-12w,標記有綠色熒光蛋白的細胞數量明顯減少,而熒光物質主要沉積在新生骨基質中,12w時,熒光顯微鏡下仍有較強的亮度(圖3)。

圖1 細胞種植后粘附與生長Fig.1 Adhension and proliferation of MSCs on ACBM

3 討論

細胞與材料的相互作用是組織工程研究的重要領域,其中細胞與材料的粘附是體外構建組織工程骨的前提和基礎[4],細胞必須與材料發生適當的粘附,才能進行遷移、增殖、分化及生物學活性的表達[5]。無論在體外,還是體內,直接也是最先與組織細胞相接觸并發生作用的是材料表面,因此細胞與材料表面的粘附相當重要,而且還將影響細胞的增殖、分化等一系列反應[6]。

圖2 MSCs-材料植入后 12w,裸鼠體內成骨Fig.2 Osteogenesis in nude mouse at 12 weeks after implantation of MSCs seeded ACBM

圖3 材料復合物側,植入4-12w成骨觀察Fig.3 Histology of the new formed bone at 4-12 weeks of cell-scaffold implantation

研究表明,MSCs表面的整合素受體可與RGD(精-甘-天冬氨酸)、人工合成的短肽如 GRGDS(甘-精-甘-天冬-絲)或者 RGDS(精-甘-天冬-絲氨酸)等配體結構結合,從而使包含或復合這些小分子結構的材料增強對種子細胞的粘附,因此,該類物質在組織工程材料中有廣泛應用[7,8]。在天然骨組織中,大多數骨基質蛋白如纖維連接蛋白、骨橋蛋白、I型膠原、骨涎蛋白等具有促進細胞粘附的RGD序列,后者可以特異性結合細胞膜整合素受體[8],從而促進細胞與材料的粘附及分化。

掃描電鏡結果顯示本實驗使用的ACBM不但有良好的網孔和表面結構,其膠原纖維在制備過程中也有良好的暴露;有利于其中的 RGD結構與MSCs的粘附[9]。

MSCs在體外具有大量擴增能力,可誘導分化為成骨細胞,能滿足體內組織工程骨對種子細胞‘質和量'的要求,而且初步的臨床研究表明修復非承重部位骨缺損效果良好[2];組織工程骨體內修復的關鍵是種子細胞在體內是否發揮作用,因此,本實驗采用近年來在組織工程及組織修復中作為示蹤細胞得到廣泛的應用,轉染GFP基因,能夠傳代并穩定表達GFP小鼠MSCs與材料復合構建組織工程骨[10,11],植入裸鼠體內,觀察細胞-材料復合后種子細胞在體內的結局。

組織學觀察顯示:實驗側移植物周圍及中央部均有大量新骨形成,而且通過軟骨內骨化成骨;而對照側見ACBM逐漸吸收。熒光顯微鏡下,4周時GFP主要表達于細胞內,隨后新生軟骨及骨基質中均有GFP的沉積,此后隨修復時間延長,骨基質中GFP的熒光強度逐漸減弱。但在骨組織中殘存部分細胞仍見較強的熒光。由此可見,表達GFP的MSCs與ACBM復合后在受體內能夠存活并且發揮成骨效應。

[1]Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematoptietic tissue[J].Science,1997,276:71-74.

[2]柴崗,張艷,劉偉,等.組織工程骨在顱頜面骨缺損臨床修復中的應用[J].中華醫學雜志,2003,83(19):1676-1681.

[3]孫新君,王正國,朱佩芳,等.脫細胞骨基質材料的特性及生物安全性觀察[J].中華創傷雜志,2005,11(23):833-837.

[4]James T T.Osteogenic Stem Cells and Orthopedic Engineering:Summary and Update[J].J Biomed Mater Res,2002,63:384-389.

[5]Damsky C.Cell-cell and cell-extracellular matrix adhesion receptors[J].Ann N Y A cad Sci,2002,961:154-155.

[6]Kilmura K,Kawamoto K,Teranishi S,et al.Role of Racl in fibronectin induced adhesion and motility of human comeal epithelial cell[J].Invest Ophthal mol Vis Sci,2006,47(10):4323-4329.

[7]Jin WL,Yun HK,Ki DP,et al.Importance of integrin b1-mediated cell adhesion on biodeg radable polymers under serum depletion in mesenchymal stem cells and chondrocytes[J].Biomaterials,2004,25:1901-1909.

[8]Biological evaluation of RGD peptidomimetics,designed for the covalent derivatization of cell culture substrata,as potential promotors of cellular adhesion[J].Biomaterials,1999,20(19):1773-1782.

[9]孫新君,王正國,朱佩芳,等.重組人骨形態發生蛋白2/脫細胞骨基質材料復合移植修復兔骨缺損的研究[J].中華實驗外科雜志,2005,3(22):287-289.

[10]Rei O,Hiroshi M,Atsushi W,et al.Osteogenic and chondrogenic differentiation by adipose derived stem cells harvested from GFP transgenic mice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,313:871-877.

[11]Mann BK,Gobin AS,T sai AT,et al.Smooth muscle cell growth in photopolymerized hydrogels with cell adhesive and proteolytically degradable domains:synthetic ECM analogs for tissue engineering[J].Biomaterials,2001,22:3045-3051.