巨噬細胞在創面愈合中的作用研究進展

郭敏 (綜述),徐祥,黃宏 (審校)

(1.重慶醫科大學第二附屬醫院創傷燒傷科,重慶 400010;2.第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所,創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

早在1975年,Leibovich和Ross在實驗中就發現,以巨噬細胞抗血清和氫化可的松去去除中性粒細胞后,傷口愈合過程卻無明顯影響。1980年,Leibovich等人又將巨噬細胞激除傷口局部的巨噬細胞后,傷口纖維形成和血管生成受阻,愈合明顯減慢。而以同樣的方法活劑葡聚糖加入傷口局部,發現局部的巨噬細胞明顯增多,并且血管生成提前,膠原合成增加,上皮形成加快,傷口牽張強度增加。近幾年的實驗研究有相似結果,在大鼠皮膚傷局部直接加入活化巨噬細胞的培養上清液,可導致傷口的膠原蛋白合成增加,傷口抗張強度增強。在老年個體,常因免疫功能低下、巨噬細胞功能不良導致創傷愈合延遲。由此可見,巨噬細胞在組織修復中起著非常重要的作用。

巨噬細胞是創傷愈合和組織修復過程的“總指揮”(orchestra leader),對整個愈合過程具有不可替代的指導作用[1-3]。它通過吞噬作用、分泌一些酶以及產生活性基團如:NO、O2+和H2O2等,繼續清除損傷細胞與變性壞死組織,殺滅細菌,起到清創作用;更主要它具有強大的分泌功能,合成釋放多種細胞因子和生長因子等生物活性物質,直接或間接地調控創面愈合過程,它是創傷愈合過程中主要細胞因子和生長因子的重要來源。巨噬細胞分泌的細胞因子作用廣泛而且復雜,其中不但有促進愈合的細胞因子,也有抑制愈合的細胞因子。它促進創面愈合的生物學行為不僅發生在創傷愈合過程的炎癥、增殖階段,還參與創傷愈合的塑形期,并且與病理性瘢痕的形成也有顯著的相關性。它對膠原具有雙向的調節作用,既可刺激膠原纖維增生,又可促使膠原降解。可見,巨噬細胞調控創面愈合的作用貫穿于愈合過程的始末,因此,巨噬細胞在創面愈合中承擔了重要角色。見圖1。

1 巨噬細胞的浸潤與活化

正常皮膚組織中巨噬細胞甚少,僅約1～2個/mm2,而在創面修復期則可多達正常的5倍。正常皮膚組織中的巨噬細胞和血管中的單核細胞處于未活化狀態。而未活化巨噬細胞的吞噬功能和分泌細胞因子的能力很有限,巨噬細胞受到某些物質刺激后即可被活化。巨噬細胞一旦活化后不僅其吞噬功能顯著增強,同時,細胞代謝和分泌能力也顯著增強,合成分泌一系列生長因子和細胞因子參與調節損傷組織中血管再生、成纖維細胞功能和細胞外基質的生成。

損傷后,繼血小板、中性粒細胞(傷后數分鐘-24小時)之后,血液中的單核細胞在多種炎癥介質趨化下很快到達創面,并轉化為巨噬細胞和部分樹突狀細胞,發揮抗原提呈作用,激活獲得性免疫。通常巨噬細胞在傷后第1天開始增加,隨后數量逐漸增多,傷后2～4.

圖1 巨噬細胞在組織修復中的主要作用Fig.1 The principal effects on tissue repair of macrophage

天數量最多,傷后第3天基本完全取代PMN成為創面最主要的免疫細胞。傷后第7天達到肉芽組織中細胞總數的80%以上,成為創面中數量最多、停留時間最長的一種炎癥細胞。巨噬細胞不僅在促進創傷愈合由炎癥期向增生期轉化起著重要作用,而且也是創傷愈合由炎癥期向增生期轉化的重要標志[4]。

在炎癥早期,外周血循環單核細胞在趨化因子的作用下募集至創面,炎癥早期由血小板合成分泌的如血小板源性生長因子(PDGF)和轉化生長因子(TGF-β)對巨噬細胞產生中度的趨化效應[5],創面早期浸潤活化的巨噬細胞產生的單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)[1,6]、巨噬細胞炎癥蛋白-1、2(macrophage inflammatory protein-1、2)TNF-α和 IL-1等都是巨噬細胞強有力的趨化因子。繼而在血小板和內皮細胞等釋放的炎癥介質如白細胞三烯、補體C5a、以及細菌產物如 LPS也有促進單核細胞和PMN滲出的作用,而一些非炎癥介質如結締組織生長因子FGF、PDGF以及血凝副產物如血纖維蛋白肽、降解的膠原碎片、彈力蛋白、激活的凝血酶等都具有刺激PMN和單核細胞滲出至創面的作用。

創面巨噬細胞的活化是在多種細胞因子的作用下而完成的。巨噬細胞的早期活化因子主要來自血小板,血小板釋放TGF-β、PDGF和血小板活化因子(PAF)均能激活巨噬細胞,而血小板分泌的這些細胞因子在創面中約12～14小時之內就被滅活;此外,損傷的內皮細胞也能分泌多種能刺激活化巨噬細胞的細胞因子,如TNF-α;活化的巨噬細胞本身也分泌 IL-1、IL-2、TNF-α、PDGF 和 T 淋巴細胞分泌IFN-γ等細胞因子也能激活巨噬細胞;細菌產物也是巨噬細胞活化的重要刺激物[7];早期激活的巨噬細胞還能以旁分泌的形式進一步激活其它巨噬細胞。

活化的巨噬細胞是執行不同免疫功能的復雜細胞群體。目前至少發現了三種生物學功能不同的活化的巨噬細胞[7],它們執行著不同的免疫功能。最早發現的是依賴于IFN-γ誘導的經典活化的巨噬細胞(classically activated macrophage),IFN-γ和TNF-α或TNF誘導劑是經典活化必須的兩個細胞因子。在有LPS存在時能合成分泌NO.這些經典活化巨噬細胞表現為表面分子MHCⅡ和B27(CD86)的上調和提高了抗原呈遞和殺傷細胞內病原體的能力。這些細胞遷移到炎癥部位,接觸病原體并降解它們。經典活化的巨噬細胞具有重要的分泌功能,可以分泌多種促炎細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α等,還可以分泌IL-12和趨化因子CXCL9(Mig)和CXCL10(IP-10)。經典活化的巨噬細胞刺激T細胞產生IFN-γ,參與Th1型免疫應答。

其次,是替代性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophage),這類巨噬細胞受IL-4、IL-13、糖皮質激素等的作用活化,甘露糖受體和清道夫受體上調,而產生NO的能力下降,因此殺傷細胞內病原體的能力下降。這類巨噬細胞主要參與調節創傷愈合、血管生成和細胞外基質(ECM)沉積的功能。提示它們的功能是參與組織修復,而并非對病原體產生吞噬與殺傷效應。

第三類活化巨噬細胞是Ⅱ型活化的巨噬細胞(Ⅱtype-activated macrophage)。這類巨噬細胞是在IgG免疫復合物存在的情況下,由誘導巨噬細胞經典活化的刺激分子來誘導活化的巨噬細胞。該類細胞活化也需要兩個信號,第一個信號是Fcγ Rs的配體,第二個信號是TLRs的信號和通過CD40或CD44的信號。能合成分泌大量的IL-10是其最大的特點,提示它們有重要的抗炎作用。Ⅱ型活化的巨噬細胞還能夠誘導Th2型免疫應答。與經典活化巨噬細胞相同,Ⅱ型活化的巨噬細胞也能分泌IL-1、IL-6、IL-10 、IL-12 和 TNF-α等細胞因子。

此外,按照創傷后損傷部位募集的巨噬細胞的功能將其分為3類[8]:殺傷巨噬細胞、炎性巨噬細胞和修復巨噬細胞。殺傷巨噬細胞主要行使吞噬異物、清除壞死組織碎片的功能;炎性巨噬細胞產生PDGF 、TGF-β、bFGF,趨化內皮細胞和成纖維細胞遷移至創面,并刺激其增殖;修復巨噬細胞分泌PDGF和胰島素樣生長因子,參與創面細胞外基質改造和重塑。炎性巨噬細胞和修復巨噬細胞之間的平衡是修復成功的關鍵,它們是參與組織修復重要的細胞群體。

創面組織中的巨噬細胞活化后,分泌大量細胞因子通過自分泌和旁分泌的形式進而對巨噬細胞的浸潤與活化進行放大,確保了機體在創傷后能迅速調動大量巨噬細胞參與創面修復。

2 巨噬細胞對創傷愈合過程的調控

巨噬細胞一方面作為炎癥階段主要的吞噬細胞,負責清除損傷細胞和病原體等;另一方面釋放多種生物活性物質調控創傷愈合過程。活化后的巨噬細胞能分泌多種細胞因子參與創面修復。通過合成分泌 PDGF 、EGF 、TGF-α、TGF-β、IL-1、肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)、巨噬細胞衍生生長因子(MDGF)、野生型 P53活化片段(WAF)等,趨化修復細胞、成纖維細胞和內皮細胞,刺激成纖維細胞的有絲分裂和新生血管的形成,以促進肉芽組織形成。實驗表明,阻斷傷口巨噬細胞的浸潤、活化會嚴重阻礙組織的修復。Shirafuji等[9]發現,巨噬細胞浸潤受阻是手術后病人傷口愈合受阻的一個重要原因。

2.1 巨噬細胞的吞噬和殺菌作用

炎癥是機體抵御外來感染、創傷等的保護反應,強烈炎癥反應本身可造成組織過度損傷,從而影響創面的修復過程。巨噬細胞在修復炎癥期的突出作用表現在巨噬細胞能識別并清除壞死組織、細胞碎片和病原體,清理創面,為修復作準備。而另一方面,通過清除病原體和壞死組織巨噬細胞可以限制炎癥反應的強度。病原體和異物刺激的持續存在,將導致巨噬細胞的過度激活,合成分泌促炎細胞因子增加,從而加重組織損傷。因此,可以說炎癥反應是雙刃劍,既有保護作用,又有破壞效應,而作為主要炎癥效應細胞的巨噬細胞數量和激活程度決定了炎癥反應的強度。

在創面清創過程中,巨噬細胞在接觸到細菌、異物、衰亡的細胞時,即伸出偽足將其粘附和包圍,并吞入胞質形成吞噬小體和吞飲泡。吞噬小體與初級溶酶體接觸、融合,成為次級溶酶體,溶酶體酶消化分解異物,殘留的異物則形成殘余體。此外,巨噬細胞吞噬作用可通過Fc受體、C3受體介導促進其更強的免疫吞噬功能,吞噬壞死組織、崩解的中性粒細胞和細菌崩解產物。巨噬細胞不表達髓過氧化物酶,但它通過產生NO繼續殺滅創面細菌。激活巨噬細胞一氧化氮合成酶(iNOS)產生 NO,通過TNF-α和IL-1與過氧化物氧自由基相互作用產生毒性更強的過氧化亞硝酸鹽和羥基;激活的巨噬細胞合成和釋放的多種活性因子如IL-1、淋巴細胞活化因子等發揮其細胞毒性作用,殺傷靶細胞。

2.2 巨噬細胞在組織修復中血管形成中的重要調節作用

血管生成是組織修復的前提和基礎,是創傷修復過程中的重要環節。修復創面的肉芽組織中含有大量的新生血管。新生血管的形成主要是由內皮細胞遷移和分裂增殖而完成。激活的巨噬細胞分泌大量的促血管生成因子,主要有成纖維細胞生長因子(FGFs)、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGFs)、血小板源生長因子(PDGFs)、轉化生長因子α(TGF-α)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、胰島素樣生長因子(IGF-l)、IL-10、IL-8和 IL-6等。例如 VEGF、IL-6和 IL-8通過趨化、募集內皮細胞到達創面,而VEGF、FGF、TGF-α和TGF-β等細胞因子通過促進內皮細胞增殖、分化而促進新生血管形成。其中VEGF和bFGF是巨噬細胞分泌的早期最主要的血管生長刺激因子,對血管生成有強烈的促進作用。bFGF在創傷修復早期(24小時內)升高,與 bFGF不同,VEGF的高水平不出現在創傷早期,它通常在創傷后7天才達到高峰,因此,VEGF是持續誘導血管生長的主要刺激因子,它與bFGF均參與血管EC遷移、增殖和管樣結構的形成。早有實驗證明,從傷口分離出的巨噬細胞注入兔角膜,能明顯誘導血管形成。

浸潤在創傷組織中的巨噬細胞還可以分泌cathelicidin多肽,這種多肽達到一定濃度后,直接作用于血管內皮細胞,促進新生血管形成[10]。

此外,巨噬細胞除分泌細胞因子影響血管內皮的生成外,還通過影響細胞外基質(ECM)的生成而調節血管的形成。因內皮趨化、遷移需要血管內皮基膜和局部基質的降解,巨噬細胞可通過釋放金屬蛋白酶(MMPs,如膠原酶)、彈性蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等降解基質。而另一方面,通過合成部分基質分子如纖維連接蛋白(fibronectin,Fn)等改變基質的組成,或通過釋放單核細胞因子等作用來調節基質成分,有利于血管形成。在血管生成早期,絲氨酸蛋白酶如組織型(t-PA)和尿激酶型(和u-PA)纖溶酶原激活物激活的纖溶酶,與MMPs共同作用,除了水解基底膜,利于EC遷移和管樣結構的形成外,還可以促進白細胞、血管平滑肌細胞等向血管生成部位遷移。這些細胞到達后,蛋白水解酶繼續作用促進血管成熟。新生血管成熟的特征為新的基底膜沉積和EC增殖下調。同時,血管內皮分泌MMPs量開始降低,而組織抑制物TIMP及其蛋白含量升高,這不僅可阻斷微血管繼續生成,以及穩定已生成的微血管并防止其退化[11]。同時,也有利于基質重塑和新生血管成熟[13]。

創面愈合過程中新生血管生長是一個高度受控和有序的過程。在正常的創傷愈合過程中,高度增生的毛細血管會在愈合完成時迅速退化。要完成這一退化過程,誘導因子和抑制因子之間的平衡須恢復到毛細血管退化和EC重新靜止這一水平。巨噬細胞可在新生毛細血管消退階段分泌有助于毛細血管退化的細胞血小板反應素1(thrombospondin 1,TSP-1)。新近報道TSP-1可以在炎癥反應早期減少巨噬細胞的聚集和MCP-1的分泌,TSP-1缺陷小鼠的血管生成增加[14]。

2.3 巨噬細胞對成纖維細胞的調節

成纖維細胞是組織修復的主要功能細胞,巨噬細胞主要通過釋放的一系列生物活性物質對成纖維細胞的增殖、功能起著重要的調節作用,并且巨噬細胞在愈合的不同時期分泌不同的產物,對成纖維細胞起雙向調節作用。一方面是促進成纖維細胞增殖的活性物質如巨噬細胞源性生長因子(macrophagede derived growth factor,MDGF)、IL-1、EGF 、成纖維細胞生長因子(fibroblast grow th factor,FGF)、前列腺素E2等外;另一方面是分泌抑制成纖維細胞增殖活性的物質如干擾素γ、TGF-β、前列腺素E2(PGE2)和IL-6等[14,15];巨噬細胞還分泌一些細胞因子如 TNF-α、IL-1、TGF-β等它們在不同的劑量和不同的條件下對成纖維細胞起不同的調節作用,甚至是相反的結果。因此,巨噬細胞對成纖維細胞的調節作用是所有分泌產物的綜合作用的結果。但實驗發現傷口局部注射巨噬細胞具有促進血管化、提高膠原含量、增強傷口抗裂強度等作用,而這些作用又可被相應的單克隆抗體所抑制。由此表明:傷口愈合過程中,巨噬細胞釋放的多種細胞因子的綜合效應是促進組織愈合的作用占主導地位。巨噬細胞在肉芽組織增生期不僅是數量最多的細胞成分,而且它能高表達PDGF、bFGF和 TGF-β等細胞因子。表明巨噬細胞在成纖維細胞增殖和膠原生成中起著重要作用。

手術切口模型的實驗研究中發現,術后的腹腔巨噬細胞比正常腹腔的巨噬細胞具有明顯刺激成纖維細胞增殖的作用。術后腹腔巨噬細胞的培養上清液對成纖維細胞有明顯的促增殖作用,尤其以術后4天、7天的巨噬細胞上清液為最顯著,而術后28天的作用下降,與術前的巨噬細胞上清液無差別。對術后巨噬細胞培養上清液的提取物進行研究,其結論基本一致。即術后5天的提取物對腹膜組織修復細胞的促增殖作用最強,術后2天、10天的作用不明顯。從皮膚創面直接獲取巨噬細胞,觀察其培養上清液對成纖維細胞的增殖和膠原合成的影響,發現在傷后4、7、21、28天中有一個從弱到強再到弱的趨勢,與創傷愈合的進程是一致的。這些研究結果都表明巨噬細胞在創傷愈合的不同時期可分泌不同的產物,對成纖維細胞起雙向調節作用。

2.4 巨噬細胞對(纖維組織形成的影響)膠原纖維合成的調節

巨噬細胞參與了創面修復的重塑期。巨噬細胞通過分泌的生長因子PDGF、IGF-1、bFGF引起纖維增生,另一方面它分泌合成酶類如彈性蛋白酶、纖溶酶原激活劑和膠原酶等降解基質,調節基質形成。其中,降解膠原的酶主要為膠原酶。例如,巨噬細胞可直接產生一些基質金屬蛋白酶(MMPs)[16],或者通過釋放VEGF誘導MMPs在內皮細胞中產生。巨噬細胞雖能分泌膠原酶,但分泌量少而作用小,巨噬細胞在重塑期的調節作用主要表現促進成纖維細胞分泌更多的膠原酶。膠原酶正常時處于非活化狀態,能被巨噬細胞的產物所活化和調節,如纖溶酶原激活劑(Plasminogen activator)使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶,后者末活化的膠原酶變成活化的膠原酶。然而活化的膠原酶和纖維蛋白溶酶可被α 2-巨球蛋白所抑制。這種活化和抑制的系統被認為是膠原降解的一種控制調節機制。膠原分子一經膠原酶解離,由巨噬細胞釋放蛋白酶(如纖維蛋白溶酶)進一步將其消化成碎片和游離氨基酸。膠原的生成和降解能否達到平衡與創面修復結局密切相關。組織修復過度將導致局部產生大量膠原基質降解減少而形成臨床上常見的瘢痕[17];組織修復不足即基質降解過度將會導致難愈創面。此外,巨噬細胞降解膠原的作用還受某些因素的影響,如糖皮質激素抑制巨噬細胞向傷處游走,類固醇激素抑制巨噬細胞釋放膠原酶和纖維蛋白溶酶原的活化物質。由此可見,巨噬細胞在傷口愈合中,對平衡膠原代謝方面起著復雜而重要的作用。

[1]Kunimoto BT.Growth factors in wound healing:the next great innovation?[J].Ostomy Wound Manage,1999,45:56-66.

[2]Henry G,Garner W.Inflammatory mediators in wound healing[J].Surg.Clin.North Am,2003,83:483.

[3]Gillitzer R,Goebeler M.Chemokines in cutaneous wound healing[J].J Leukoc Biol,2001,69:513-21.

[4]Dovi JV,He Li-Ke,DiPietro LA.Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice[J].J Leukoc Biol,2003,73:448-455.

[5]陳曉紅,程天民.中性粒細胞在組織修復中的作用[J].中國藥理學報,2001,17:373-376.

[6]Martin P,Leibovich SJ.Inflammatory cells during wound repair:the good,the bad and the ugly[J].T RENDS in Cell Biology,2005,15(11):659-607.

[7]Park JE,Barbul A.Understanding the role of immune regulation in wound healing[J].The American Journal of Surgery,2004,187:11S-16S.

[8]Atif D,Agaiby,Dy son M.Immuno-inflammatory cell dy namics during cutaneous wound healing[J].J Anat,1999,195:531-542.

[9]Martin P.Wound healing aiming for perfect skin regeneration[J].Science,1997,276:75-81.

[10]Dipietro LA,Reintjes MG,Low QE,et al.M odulation of macrophage recruitment into wounds by monocyte chemoattractant protein21[J].WoundRepair Regen,2001,9(1):28-33.

[11]郭強,熊思東.巨噬細胞的三種活化[J].生命的化學,2004,24(2):87-88.

[12]Waugh HV,Sherratt JA.Macrophage Dynamics in Diabetic Wound Healing[J].Bulletin of Mathematical Biology,2006,68:197-207.

[13]Shirafuji T,Oka T,Sawada T,et al.The importance of peripheral blood leukocytes and macrophage infiltration on bronchial wall wound healing in rats treated preoperatively with anticancer agents[J].Surg Today,2001,31(4):308-316.

[14]Agah A,Ky riakides T R,Lawler J,et al.The lack of thrombospondin-1(TSP1)dictates the course of wound healing in double TSP1/TSP2-null mice[J].Am J Pathol,2002,161(3):831-839.

[15]Rodegers KE,iZerega GS.M odulation of peritoneal reepithelialization by postsurgical macrophages[J].J Surg Res,1992,53:542-548.

[16]M ater RB,Reichner JS,Albina JD.Interleukin-6 activity in wounds[J].Am J Physio,1994,266:1840-1844.

[17]Kvanta A,Shen WY,Sarman S,et al.M atrix metalloproteinase(MMP)ex pression in experimental choroidal neovascularization[J].Curr Eye Res,2000,21:684-690.

[18]O＇Kane S.Wound remodelling and scarring[J].J Wound Care,2002,11(8):296-299.