棉籽餅中棉酚降解菌株的分離及脫毒效果初探

李 佳，袁洪水，朱寶成

河北農業大學生命科學學院，河北 保定 071001

我國是一個產棉大國，而棉籽餅中粗蛋白含量達到34%～38%，高出大米和小麥5～8倍[1，2]，可作為一種理想的蛋白質飼料，一定程度上彌補我國蛋白飼料資源的不足。但是，棉籽餅中含有游離棉酚，直接利用可引起動物棉酚中毒，給養殖戶造成巨大的損失[3]。因此，對棉籽餅進行脫毒處理，從而更高效、更安全的利用棉副產品對于畜牧養殖業來說意義重大。

本文是從棉田土壤中篩選能夠降解棉籽餅中棉酚的高效菌株，并對其實際應用效果進行了初步驗證，希望為棉籽餅這一豐富的粗飼料資源能更好的應用于畜牧業生產貢獻一份力量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 棉籽餅來源

所用棉籽餅原料是河北保定河間某榨油廠的普通壓榨油餅，在實驗室經過粉碎等工序，使其成為細度為篩孔直徑小于0.25 mm的棉籽餅粉。

1.1.2 培養基

棉酚培養基平板：將棉酚5 g加50mlPDA培養基加入50ml蒸餾水，制成平板。

棉酚培養液：棉酚5 g加入100mlPDA培養液。

固態發酵培養基：由棉籽餅和玉米粉等成分組成。

生理生化鑒定培養基，PDA培養基見《真菌鑒定手冊》[4]。

1.2 方法

1.2.1 游離棉酚標準曲線測定

制備棉酚標準溶液，采用間苯三酚法[5]測定各樣品溶液的吸光度。根據樣品溶液棉酚含量（μg）和測定的吸光度值繪制標準曲線并進行回歸計算。

1.2.2 棉酚降解菌株的初篩

采用常規涂布法，將土樣稀釋液涂布棉酚培養基平板，37℃培養。挑取生長較快的菌落并純化。

1.2.3 棉酚降解菌株的復篩

將初篩得到的菌株接種于棉酚培養液中，37℃，180r/min搖床培養48 h。培養液用0.2 μm微孔濾膜過濾。取過濾除菌的發酵液以間苯三酚法[5]測定其棉酚降解效果。篩選降解效果出現較早且降解活性較高的菌株。

1.2.4 供試菌株的形態鑒定

將活化后的供試菌株劃線接種于PDA培養基平板上，37℃培養24 h，觀察菌落形態。插片培養供試菌株，在光學顯微鏡下觀察其菌體形態。

1.2.5 供試菌株的生理生化鑒定

選取了V.P試驗、淀粉水解等生理生化試驗，具體方法見《真菌鑒定手冊》[4]。

1.2.6 供試菌株對棉籽餅中棉酚實際降解能力的初步考察

將活化后的菌株接種含有棉籽餅粉的固態發酵培養基，37℃靜置培養72 h后，以間苯三酚法測定發酵前后發酵培養基提取液中棉酚的含量并記錄。

2 結果與分析

2.1 游離棉酚標準曲線測定

根據棉酚含量與吸光度值進行回歸計算，得回歸方程：y=64.867x+3.5527（R2=0.9964）。

2.2 棉酚降解菌株的篩選

初篩得到菌株16株，經復篩得到1株降解活性較高的菌株，對棉酚的降解率均超過75%。

2.3 菌種的初步鑒定

2.3.1 形態觀察

菌株M12菌落初期呈白色，絨毛狀，后期菌落黃色，產黃色孢子，菌絲細長，基內菌絲呈白色絨毛狀，不透明，孢子梗端有孢子囊，布滿孢子，孢子圓形，呈黃色，菌絲有隔。

2.3.2 生理生化鑒定結果

對菌株進行生理生化試驗鑒定，結果表明：V-P測定、過氧化氫酶試驗、糖醇發酵試驗、產氨試驗、甲基紅、明膠液化、硝酸鹽還原和淀粉水解試驗呈陽性；硫化氫試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、檸檬酸鹽利用和吲哚反應呈陰性。參照《真菌鑒定手冊》[4]初步確定菌株M12屬于魯氏毛霉（Mucor rourianus）。

2.4 棉籽餅實際脫毒效果的研究

通過供試菌株對棉籽餅的發酵，發現菌株M12脫毒率達80.1%，棉酚殘余量均不足80 mg/kg，達到我國國家標準飼料衛生標準的相關規定（GB13078-2001）：飼料原料棉籽餅中游離棉酚含量≤1200 mg/kg，具有進一步開發的潛力。

3 討論

目前，常用的棉籽餅脫毒方法有：物理法、化學法及生物發酵脫毒。其中物理法和化學法處理后，棉籽餅產品的營養成分會遭到破壞或流失，同時適口性和采食量也受到了影響[6]。采用微生物發酵棉籽后，其蛋白質和氨基酸顯著提高，適口性增加，同時活細胞數也大幅度提高，是非常優良的微生物飼料添加劑[7-8]。因此，采用微生物對棉籽餅脫毒是一種低成本、高效率[8]、工藝設備簡單的脫毒方法，具有很好的發展潛力。

[1]石秀俠，程茂基，蔡克周，等.棉籽餅有毒物質及其脫毒方法研究進展[J].飼料博覽，2005，6：8-10.

[2]邢志剛，周安國，任花池，等.精氨酸與賴氨酸適宜比例研究進展[J].中國飼料，2004，15：11-13.

[3]趙順紅，張文舉.棉籽餅粕生物脫毒的研究進展[J].飼料視角，2007，1：54-55.

[4]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海科學技術出版社，1979.

[5]敖維平，曲明悅.飼料中游離棉酚快速測定適宜條件的篩選[J].中國飼料，2007，20：24-27.

[6]何濤，滕達，張海軍，等.微生物降解棉酚的響應面分析優化[J].生產與科研經驗，2008，4（34）：71-74.

[7]張慶華，趙新海，鐘麗娟，等.三菌株協同固態發酵對棉粕脫毒效果及其生物活性的影響[J].飼料工業，2007，18（28）：37-38.

[8]Nagalakshm I D, Sastry V R B, Pawde A.RumenFementation Pattems and Nutrient Digestion in LambsFed Cottonseed Meal Supplemental Diets[J].AnimalFeed Science and Technology, 2003, 103: 1-4.