骨髓間充質干細胞的研究進展

王麗娟，張媛媛

（赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000）

骨髓間充質干細胞的研究進展

王麗娟，張媛媛

（赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000）

骨髓間充質干細胞主要存在于全身結締組織和器官間質中,具有多種生物學特性及分離、培養的方法,在適宜的微環境里具有多向分化潛能.本文就骨髓間充質干細胞的分離、培養及其誘導分化的最新進展做一綜述.

骨髓間充質干細胞；分離；培養；誘導分化

骨髓間充質干細胞是骨髓中除造血干細胞外的另一類具有高度可塑性的細胞群體,在特定的誘導條件下可以向中胚層細胞如成骨細胞、脂肪細胞和肌細胞；外胚層的神經細胞；內胚層的肝細胞分化,以滿足基礎研究和臨床應用,同時具有易在體外培養、誘導和擴增等特性,被認為在基因治療、細胞治療、組織工程等領域具有廣泛的臨床應用前景.現就骨髓間充質干細胞（BM-MSCs）的分離、培養及其誘導分化的最新進展做一綜述.

1 骨髓間充質干細胞的生物學特性

1.1 骨髓間充質干細胞的形態特征

原代接種后約24h后就見有細胞貼壁，此時貼壁的細胞為單個,形態大部分為圓形，首次換液后5～7d可見由幾十個到數百個細胞組成的集落,細胞形態呈梭形、三角形或星形.原代細胞培養10d左右,細胞快速增殖,每個集落中的細胞不斷增殖呈“漩渦狀”,培養2周左右,每個小集落形成約數百致上千個細胞的大集落,集落交界處出現重疊、融合.傳代后的mmSCs增殖能力不斷增加.

1.2 超微結構

透射電鏡下骨髓間充質干細胞形態不一，多為圓形，可見核仁，核漿比例大，胞質內有分泌小泡，細胞器少，為低分化的幼稚細胞.

目前骨髓間充質干細胞并沒有找到理想的特異性標志,它既有間質細胞的表面抗原,又有內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞的表面抗原,但不表達造血細胞的表面標志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、 CD8等,也不表達與人白細胞抗原(HLA)識別有關的共刺激分子B71、B72及主要組織相容性復合物Ⅱ類分子如HLA-DR抗原等，低表達：CD11b、CD54、CD106等，高表達：CD29、CD44、CD49e、CD105、CD13、CD48、CD71、CD56、CD90、CD166.在自然生長情況下,即使是1個細胞形成的克隆,其基因表達也呈多種細胞的表達特征.不同來源的骨髓間充質干細胞具有不同的生物學性質.標本來源、分離方法不同導致獲得的細胞群不同,檢測的細胞代次不同或培養基存在差異等種種因素,導致骨髓間充質干細胞獲得或失去某些表面標記物表達的可能性不可排除.目前,Martinez等提出,正常骨髓中MSCs是惟一表達神經節苷脂-2(GD2)的細胞,因而GD2是第1個被報道的區分骨髓間充質干細胞和其他骨髓細胞的單一標志.這預示著GD2在對骨髓間充質干細胞的生物學研究和臨床應用上將有重要價值.骨髓間充質干細胞必須具備的特征是:體外培養時呈成纖維樣集落形成單位,并貼壁生長,以及能夠自我更新、分化為3種以上間質細胞系.骨髓間充質干細胞周期研究表明,僅有10%MSCs處于S+G2+M期而絕大部分細胞停滯在G0+G1期.

2 骨髓間充質干細胞的分離方法

骨髓間充質干細胞最初的分離培養方法是由Friedenstein在70年代中期建立的.目前從體內分離骨髓間充質干細胞常用的方法有5種:全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心法、紅細胞裂解液分離法、特制培養板篩選法、流式細胞儀分離和免疫磁珠分離法.

2.1 貼壁分離法

全骨髓貼壁細胞分離法是根據骨髓中骨髓間充質干細胞貼壁生長,而造血系細胞懸浮生長的特性對二者進行分離,每次換液去除懸浮生長的造血細胞；傳代時利用骨髓間充質干細胞較淋巴細胞、單核細胞易脫落的特點,保證骨髓間充質干細胞在短時間內與培養瓶底分開,而淋巴細胞、單核細胞因貼壁較強仍貼附于培養瓶底，從而使骨髓間充質干細胞得到進一步純化.貼壁培養法具有操作簡便、快速、細胞在離體后很少有分離所造成的損傷等優點,但由于骨髓中大量的造血干細胞與骨髓單個核細胞中含量極低的骨髓間充質干細胞一起培養，細胞的成分復雜，需經多次換液去除懸浮未貼壁細胞，影響骨髓間充質干細胞的貼壁及觀察.

全骨髓貼壁分離法是將骨髓液注入等體積的Hanks液中，4℃1000r/min離心5min，棄上清，用Hanks液重復洗滌后培養.

2.2 密度梯度離心法

密度梯度離心法即根據骨髓中細胞成分比重的不同,提取單個核細胞進行貼壁培養,單個核細胞包括干細胞、淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態和密度與其他細胞不同，一般認為,干細胞在形態上為淋巴細胞,其密度與淋巴細胞及單核細胞的密度基本相同,分離干細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種.

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2.2.1 Ficoll分離液法

Ficoll密度梯度分離法抽取Ficoll分離液（相對密度為1.077）5.0ml,將取得骨髓液輕輕鋪于離心液上,2000r p m離心25min,此時離心管出現四個層面,小吸頭輕輕吸取第二層乳白色單個核細胞層.

2.2.2 Percoll分離液法

Percoll密度梯度分離法是將相當于2倍骨髓液體積的1.073g/ml Percoll分離液加入15ml無菌離心管內，再將抗凝的骨髓沿管壁緩慢加至分離液面上，4℃800r/min離心30min，吸取分離液面上的白色云霧狀單個核細胞層.

2.3 紅細胞裂解液分離法

有人用紅細胞裂解液溶解骨髓中的紅細胞后獲得單個核細胞.鄧近平等進一步證實采用紅細胞裂解液處理骨髓后再行接種，能提高骨髓間充質干細胞的貼壁效率，同時不影響其貼壁后的生長，是一種可行的分離方法.

2.4 特制培養板篩選法

利用MSCs的形態大小及貼壁時間的特性,設計一特殊的培養皿進行培養篩選,培養皿內套有直徑為3μm小孔的板,培養5～7d時在孔板上面貼壁的細胞即為MSCs,純度可達90%以上.

2.5 免疫磁珠或流式細胞儀分離法

通過MSCs表面帶有或缺失的抗原成分進行正選或負選,從而獲得相對純化的MSCs.單克隆抗體磁珠分離系統或流式細胞儀技術對細胞活性影響較大,而且實驗條件要求高,需要骨髓量大,從一個部位每次抽取的骨髓的量不應超過2ml,否則將因吸出物中血量的增加引起有核細胞明顯減少.

3 骨髓間充質干細胞的培養

骨髓間充質干細胞對營養條件要求高，而且含量很低，約為0.001%～0.01%，要利用骨髓間充質干細胞就必需實現其體外分離培養及擴增.王忠瓊等用含10%胎牛血清的DMEM-L G培養BM-MSCs，3d后首次換液,以后每2～3d換液1次,待細胞生長至瓶底80%～90%融合時,按1：2～3比例傳代培養.馬力等將分離的骨髓間充質干細胞濃度調整為1×106，分別加Mesencult干細胞培養基、DMEM/F 12培養基、L-DMEM培養基，各組培養基中均含有20%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素，置于C O2飽和濕度培養箱中培養,發現應用3種不同培養液培養兔骨髓間充質干細胞，結果顯示各組細胞均生長狀態良好，在細胞活性、增殖速度、貼壁率、均質性方面Mesencult培養液略優于DMEM/F 12、L G-DMEM培養液，但差異無著性意義.周新伏等分別用含10%臍帶血清、胎牛血清(F C S)、成人血清的DMEM/F 12培養基和Mesencult培養基培養，發現臍帶血清與Mesencult組培養的BM-MSCs的純度和體外誘導分化能力,優于F C S和A B型血清組,臍帶血清適合臨床應用.總之，不同培養基、不同質和量的血清、不同的種植密度、首次換液時間、都會影響MSCs的生長.大多數的學者都采用低糖DMEM培養BM-MSCs.

4 骨髓間充質干細胞的分化

BM-MSCs的多向分化潛能被認為是其最重要的生物學特征.研究表明,在不同的誘導條件下BM-MSCs能夠向不同的譜系分化，不僅可分化為間質組織如成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌肉細胞等，而且可以跨胚層分化.

4.1 骨髓間充質干細胞向脂肪細胞的分化

劉廠輝等[12]發現氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）基因在MSC向脂肪細胞分化的早期中起重要的正向調節作用,并促進脂肪分化相關蛋白(ADRP)基因和蛋白的表達，PPAR γ基因過表達可增強MSC向脂肪細胞分化的能力,縮短分化進程,提高分化效率,可能與增強ADRP的表達有關.徐道華等利用內含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、不同濃度的胰島素及胎牛血清的DMEM定向誘導BM-MSCs，發現10mg/L胰島素、0.1mm o l/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.1mm o l/L吲哚美辛、0.1um o l/L地塞米松、體積分數為0.1胎牛血清的DMEM分化誘導液定向誘導可獲得較好的成脂分化效果.徐無忌等不但用成脂誘導液將BM-MSCs成功誘導成脂肪細胞，而且還發現中藥骨康含藥血清可抑制成脂誘導劑對BM-MSCs向脂肪細胞分化的促進作用.

4.2 骨髓間充質干細胞向神經細胞的分化

BM-MSCs在體內可被誘導分化為神經細胞.蘇平等用銀杏內酯B誘導的BM-MSCs，用膜片鉗全細胞記錄方式檢測細胞內外的離子通道電流，發現銀杏內酯B誘導的MSCs,不僅具有神經細胞的外形和免疫學特征,而且具有神經元的基本電生理功能.袁維等的實驗結果表明增強型綠色熒光蛋白基因能成功的轉染BM-MSCs并有效表達，轉染后增強型綠色熒光蛋白-骨髓間充質干細胞能常規培養，持續3個月仍能穩定地表達綠色熒光.轉染后BM-MSCs在DMSO、BHA等試劑定向誘導后，獲得的神經細胞存活時間較長，觀察至第7天仍有10%神經元樣細胞存活.誘導5h后部分增強型綠色熒光蛋白轉染的骨髓間充質干細胞便可轉變為神經元樣細胞，并有軸突和樹突出現；誘導24h后絕大多數骨髓間充質干細胞都可分化為神經元，且多個神經元之間可形成網絡，說明轉染后的BM-MSCs的生物學性狀沒有發生改變.有的學者用丹參注射液在體外將大鼠BM-MSCs誘導分化為神經元樣細胞.也有報道分別用鼠腦C6膠質瘤細胞上清液和大腦皮層細胞條件培養液促進BM-MSCs向神經樣細胞分化.

4.3 骨髓間充質干細胞向肝細胞的分化

徐洪軍等將成年大鼠BM-MSCs在20μg/L肝細胞生長因子的誘導下，甲胎蛋白細胞免疫組織化學染色培養第7天即出現陽性，第14天清蛋白和細胞角蛋白18免疫組織化學染色陽性，分化為肝細胞.胡晶等用成纖維生長因子-2(FGF-2)在體外定向誘導大鼠BM-MSCs，發現誘導后BM-MSCs由棱形向多角形、卵圓形方向變化，白蛋白、CK19和糖原12d即有陽性表達,以后隨誘導時間的延長陽性率逐漸升離.20n g/mlFGF-2誘導比10n g/mlFGF-2誘導細胞白蛋白、CK19和糖原的表達量均多.20n g/mlFGF-2具有較強的誘導BM-MSCs向肝細胞樣細地分化的能力.目前，體外誘導BM-MSCs向肝細胞分化主要使用以下誘導因子：肝細胞生長因子、FGF、表皮生長因子等.但是,體外誘導BM-MSCs分化為肝細胞的關鍵因素是什么？哪一種因子誘導細胞轉化效率更高這些都尚未完全明了.

5 存在的問題及展望

近年來關于骨髓間充質干細胞的研究有了較大發展，但將骨髓間充質干細胞應用于臨床，仍面臨許多問題:（1）不同個體之間存在著生物學差異,各個實驗室條件參差不齊,分離純化細胞群的技術有待進一步提高;（2）從已有報道來看，尚沒有哪種方法能在體外將BM-MSCs全部誘導分化為所需的功能細胞，如何提高誘導BM-MSCs向功能細胞分化的分化率尚需進一步探討;（3）骨髓間充質干細胞實驗僅限于自體移植方面，在異體移植免疫反應問題上有待進一步探索.

隨著三維細胞培養移植模型的進一步發展、基因轉染技術的完善和生物可降解材料的日趨成熟，骨髓間充質干細胞移植將有更廣闊的前景，骨缺損、骨不連的治療將進入一個工程化修復重建的嶄新領域.

R329

A

1673-260X（2010）03-0070-03