孕婦外周血中游離胎兒DNA在出生缺陷產(chǎn)前診斷中的研究

王 健，趙富璽

（1.山西醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，山西太原 030001；2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室，山西大同 037009）

出生缺陷已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，通過(guò)孕婦外周血中游離胎兒DNA對(duì)出生缺陷進(jìn)行產(chǎn)前診斷是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)．隨著相關(guān)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法的不斷提高，孕婦外周血中游離胎兒DNA逐步成為出生缺陷疾病產(chǎn)前診斷可靠且敏感的指標(biāo)．現(xiàn)將十年來(lái)關(guān)于游離胎兒DNA在出生缺陷中的研究情況做一綜述．

1 出生缺陷的現(xiàn)況及其產(chǎn)前診斷的技術(shù)發(fā)展

1.1 出生缺陷的概述及現(xiàn)狀

出生缺陷是指嬰兒出生時(shí)就存在各種身體結(jié)構(gòu)、智力或代謝方面的異常．是導(dǎo)致新生兒死亡和兒童殘疾的重要原因．大部分的出生缺陷是由遺傳和環(huán)境因素所致．出生缺陷主要包括兩大類(lèi)型，一種是先天結(jié)構(gòu)畸形，如神經(jīng)管缺陷，在出生時(shí)就可以發(fā)現(xiàn)，憑臨床觀察即可確診;另一種是功能、代謝、行為異常，如先天性智力殘障，要到出生后幾個(gè)月或幾年發(fā)病才能被診斷，且需要特殊的檢測(cè)手段才能檢查出來(lái)．

全世界每年大約有500萬(wàn)缺陷嬰兒出生，每年至少有330萬(wàn)5歲以下兒童死于出生缺陷，320萬(wàn)存活兒童終身殘疾．我國(guó)《國(guó)家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報(bào)告》指出：我國(guó)每年約有80萬(wàn)至120萬(wàn)缺陷兒出生，占全部出生人口的4%到6%，其中肉眼可見(jiàn)的先天畸形兒有20萬(wàn)到30萬(wàn)；衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全國(guó)每年因新生兒缺陷所造成的直接損失達(dá)8億元，用于撫養(yǎng)殘疾兒童的醫(yī)療費(fèi)用支出高達(dá)150億元．另外，這些殘疾人給家庭造成的心理和精神負(fù)擔(dān)更是無(wú)法估量的．

1.2 出生缺陷產(chǎn)前診斷的技術(shù)發(fā)展

產(chǎn)前診斷作為出生缺陷的二級(jí)預(yù)防，對(duì)降低缺陷兒出生率起著重要的作用．目前，產(chǎn)前診斷技術(shù)項(xiàng)目包括醫(yī)學(xué)影像、生化免疫、細(xì)胞遺傳和分子遺傳等方面．B超、MRI等影像檢查在孕中期胎兒結(jié)構(gòu)異常的診斷中發(fā)揮著重要的作用，然而對(duì)功能、代謝等方面出生缺陷的診斷也存在敏感性低且假陽(yáng)性率高的弊端．生化檢查的指標(biāo)往往需多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)，但檢出率低．胎兒細(xì)胞可以作為胎兒遺傳信息的可靠來(lái)源，傳統(tǒng)的獲取胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法如羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛膜取樣等均具有創(chuàng)傷性，有的甚至造成感染、流產(chǎn)．有研究者[1]從孕婦的外周血中提取到胎兒有核紅細(xì)胞作為研究的靶細(xì)胞，但是孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞的數(shù)量很少，檢測(cè)技術(shù)相當(dāng)繁瑣．1997年，Lo[2]等發(fā)現(xiàn)在孕婦外周血中存在著游離胎兒DNA，這為非侵入性產(chǎn)前診斷提供了新的途徑．

2 孕婦外周血中游離胎兒D N A作為出生缺陷產(chǎn)前診斷重要指標(biāo)的理論依據(jù)

2.1 孕婦外周血中游離胎兒DNA的基本特征

2．1．1 來(lái)源

游離胎兒DNA的來(lái)源可能是多方面的，來(lái)自胎兒細(xì)胞的凋亡，胎兒組織或胎盤(pán)的釋放，有研究者[3]從5個(gè)假妊娠婦女的血漿中檢測(cè)到胎兒Y染色體特異序列DYS 14，且濃度與正常早期孕婦相當(dāng)．證實(shí)了游離胎兒DNA主要來(lái)源于滋養(yǎng)層細(xì)胞．

2.1.2 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

有研究表明[4-5]，早在妊娠后32 d就可以檢測(cè)到母外周血游離胎兒DNA，在第8周檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%．而且胎兒DNA的量隨著妊娠進(jìn)程不斷的增加，產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)消失，這說(shuō)明了母血中胎兒游離DNA較母血中胎兒細(xì)胞在產(chǎn)前診斷中更具優(yōu)勢(shì)．

2．1．3 生物學(xué)特性

①Chan[6]等發(fā)現(xiàn)妊娠婦女血漿中胎源性DNA分子較母源性DNA分子長(zhǎng)度短很多，可以利用瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行回收，從而達(dá)到粗略分離母胎DNA的目的．②Angert[7]等發(fā)現(xiàn)抽血后在 EDTA抗凝管中放置24 h時(shí)游離胎兒DNA都是穩(wěn)定的．近來(lái)，Zhang[8]等發(fā)現(xiàn)在采血后放置36 h的樣品中加甲醛處理可使胎兒DNA的檢出率由4．6%增加到13．1%．另外，離心之后的游離胎兒DNA在血漿中更能長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，Koide等[9]證實(shí)母血漿中游離胎兒 DNA在－20℃貯藏至少可以保存4年．Bischoff等[10]報(bào)道了采用母血干紙片檢測(cè)胎兒DNA，大大方便了標(biāo)本的采集和運(yùn)送．這都為胎兒DNA作為一個(gè)可靠的臨床診斷指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)．

2.2 相關(guān)模型的建立

目前對(duì)孕婦血中游離胎兒DNA的分析主要是以人為研究對(duì)象，鑒于倫理道德的約束，許多試驗(yàn)設(shè)計(jì)無(wú)法開(kāi)展．近來(lái)，Jimenez等[11]發(fā)現(xiàn)在懷孕的母恒河猴血清中也能檢測(cè)到游離胎兒DNA，母猴血清中游離胎兒DNA的含量隨著妊娠期的延長(zhǎng)而增加，分娩后母猴血內(nèi)游離胎兒DNA的清除非常迅速，許多研究數(shù)據(jù)均與人類(lèi)相似，表明恒河猴可以作為研究母血漿和血清中游離胎兒DNA的一個(gè)良好動(dòng)物模型．另有研究者發(fā)現(xiàn)[12]，游離胎兒DNA在妊娠鼠的外周血中也有類(lèi)似的特點(diǎn)，為今后的深入研究提供了依據(jù)．

2.3 生物學(xué)標(biāo)記物的發(fā)展

最初，是通過(guò)Y染色體特異的序列SRY、DYS 14、DYZ 3等區(qū)分母胎DNA，然而這些序列的診斷僅適用于50%的懷男性胎兒的孕婦．后有大量的研究集中在短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）上．如Vodicka[13]對(duì)21號(hào)染色體的3個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行了精確定量．Dhallan等[14]建立了通過(guò)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）區(qū)分胎兒DNA和孕母DNA并診斷胎兒染色體數(shù)目的方法．

隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用DNA甲基化進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開(kāi)始變?yōu)榭赡埽瓹him等[15]研究證實(shí)，maspin基因在胎盤(pán)細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化狀態(tài)，孕婦血漿中低甲基化的maspin序列在分娩后迅速被清除，同時(shí)發(fā)現(xiàn)母血漿中低甲基化的maspin序列中存在胎兒SNP基因型．表明低甲基化的maspin可以作為不受胎兒性別和遺傳多態(tài)性影響的通用標(biāo)記．2006年Chan等[16]發(fā)現(xiàn)了位于3號(hào)染色體的RASSF1A基因在母血細(xì)胞和胎盤(pán)間有著不同的甲基化形式，應(yīng)用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法更容易實(shí)現(xiàn)檢測(cè)．Old等研究[17]表明胎兒AIRE基因可以作為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的一個(gè)重要候選表觀遺傳標(biāo)記．

2.4 相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步

2．4．1 PCR 技術(shù)的發(fā)展

雖然孕婦血中胎兒游離DNA較胎兒細(xì)胞含量豐富，但其絕對(duì)量仍然極少，需要非常敏感的方法才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果．近年報(bào)道的用于產(chǎn)前基因診斷的PCR技術(shù)包括：①巢式PCR法，針對(duì)待檢基因設(shè)計(jì)內(nèi)外兩種引物，進(jìn)行了兩次擴(kuò)增，使PCR反應(yīng)的敏感性和特異性都得到提高．②多重PCR法，在一個(gè)反應(yīng)中應(yīng)用兩對(duì)及兩對(duì)以上引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列的PCR技術(shù)，常用于檢測(cè)同個(gè)基因的多種基因型缺失．③引物延伸預(yù)擴(kuò)增（PEP）－PCR法，主要以15 bp的隨機(jī)寡核苷酸為引物在DNA聚合酶的作用下先行對(duì)標(biāo)本中總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，使原有的基因組拷貝數(shù)量放大數(shù)十倍，以供進(jìn)一步 PCR分析的方法．④實(shí)時(shí)熒光定量（QF）－PCR法，是目前國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室推薦使用的基因診斷方法，是通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累計(jì)熒光強(qiáng)度而最終實(shí)現(xiàn)始點(diǎn)定量．⑤甲基化特異性PCR（MSP）法，是對(duì)亞硫酸氫鈉處理后的模板DNA行PCR擴(kuò)增，根據(jù)處理后甲基化和非甲基化序列產(chǎn)生的差異設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)分析目的基因的甲基化狀況，Chim等[15]用該法檢測(cè)了孕婦血漿中表觀標(biāo)記maspin．

2．4．2 基因突變?cè)\斷技術(shù)的進(jìn)步

①分子雜交和印漬（跡）法：以已知序列核酸片段作為探針，經(jīng)放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后，再與未知的目的核酸片段進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)對(duì)分離出的未知目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析．常用方法有斑點(diǎn)雜交法、Southern雜交法、基因芯片法等．②PCR相關(guān)突變?cè)\斷技術(shù)：是對(duì)PCR擴(kuò)增前后的目的基因片段進(jìn)行特殊處理后通過(guò)電泳表現(xiàn)出差異，進(jìn)而分析突變的方法．主要有PCR－限制性內(nèi)切酶譜分析（RFLP）、單鏈構(gòu)向多態(tài)性 PCR（SSCP）等．

2．4．3 DNA 序列分析法

是基因突變檢測(cè)的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)．Christina等[18]利用鳥(niǎo)槍法成功地對(duì)孕早期的9例21三體，2例18三體和1例13三體胎兒DNA進(jìn)行測(cè)序．

3 孕婦外周血中的游離胎兒D N A在出生缺陷產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

3.1 預(yù)告妊娠相關(guān)性疾病,減少胎兒的環(huán)境危險(xiǎn)因素

孕婦由于妊娠的生理變化及免疫功能的影響，易發(fā)生妊娠合并癥，進(jìn)而影響胎兒的宮內(nèi)發(fā)育，造成各種出生缺陷甚至死亡，所以盡早診斷和有效防治孕婦妊娠合并癥非常重要．研究表明，當(dāng)發(fā)生異常妊娠時(shí)，孕婦血漿DNA及游離胎兒DNA水平會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高．先兆子癇是較常見(jiàn)的妊娠相關(guān)性疾病，該病患者血漿胎兒DNA濃度較正常增加了5倍，這種變化不僅發(fā)生在臨床表現(xiàn)之前，還與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[19]．胎兒DNA亦可作為早產(chǎn)的標(biāo)志，早產(chǎn)時(shí)胎兒DNA濃度明顯升高，而且保胎成功后胎兒DNA濃度會(huì)有所下降．另外胎盤(pán)感染、先兆流產(chǎn)[20]、前置胎盤(pán)等均有胎兒DNA濃度的異常．

3.2 診斷相關(guān)胎兒基因,預(yù)防先天性疾病

3．2．1 性連鎖遺傳病

性連鎖遺傳病種類(lèi)很多，以X－連鎖隱性遺傳病為主，常見(jiàn)的有血友病、假性肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、紅綠色盲等．?dāng)y帶致病基因的母親不會(huì)使女兒患病，所以沒(méi)有必要對(duì)女胎孕婦行產(chǎn)前基因診斷．患X－連鎖顯性遺傳病的父親一定會(huì)使女兒致病，Y－連鎖的疾病一定會(huì)遺傳給兒子．所以早期的性別診斷可以使我們有目的地對(duì)患兒行相關(guān)的干預(yù)．研究[21]證實(shí)DYS14是孕早期最有效的診斷胎兒性別的指標(biāo)．

3．2．2 RhD 血型不合性溶血

RhD陰性婦女在第二胎孕RhD陽(yáng)性胎兒時(shí)，可發(fā)生RhD血型不合而導(dǎo)致新生兒溶血、核黃疸甚至死亡，因此產(chǎn)前確定胎兒的RhD血型對(duì)RhD陰性的孕婦很重要．Muller等[22]準(zhǔn)確地檢測(cè)了1 113例RhD陰性孕婦外周血中胎兒RhD基因型，證實(shí)了該項(xiàng)檢測(cè)的臨床可行性．

3．2．3 胎兒非整倍體病

胎兒非整倍體病是目前致胎兒出生缺陷的重要原因．其中21、18、13及性染色體數(shù)目異常占出生后染色體異常總數(shù)的95%．有研究者通過(guò)檢測(cè)相對(duì)染色體劑量（RCD）的方法診斷21三體綜合征，先設(shè)置一個(gè)非21染色體上的DNA序列為參照，測(cè)量游離胎兒21染色體來(lái)源的DNA序列的量，通過(guò)比較兩者的量，測(cè)得相對(duì)染色體劑量（RCD），21染色體正常的胎兒RCD值為2：2，而21三體胎兒的RCD是3：2[23]．也有研究者利用 18染色體上父源性和母源性某等位基因的表觀學(xué)差異，測(cè)雜合子胎兒的等位基因比率（AR），正常胎兒AR是1：1，而18三體胎兒的基因比率是2：1[24]．

3．2．4 診斷父系遺傳的單基因病變

孕母外周血中的游離胎兒DNA不僅用于有效診斷父源的顯性遺傳病如肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、軟骨發(fā)育不全、HD（慢性進(jìn)行性舞蹈病）[25]等，也逐步應(yīng)用于父源的隱性遺傳病的產(chǎn)前診斷，Li[26]等成功地對(duì)父源性不同類(lèi)型的β－地中海貧血突變體等位基因進(jìn)行了診斷．

4 面臨的困難和技術(shù)挑戰(zhàn)

孕婦外周血中游離胎兒DNA在預(yù)防出生缺陷的產(chǎn)前診斷中已取得了一定的成績(jī)，然而要進(jìn)一步發(fā)展仍面臨著眾多難題：①孕婦外周血中游離胎兒DNA只占母總DNA的3%～6%，只有在胎兒DNA的富集方面有所突破，才能有效地提高診斷的陽(yáng)性率．②現(xiàn)階段的研究還局限于母體中分離出來(lái)的胎兒DNA片段，所以要擴(kuò)大它的應(yīng)用范圍，新的生物學(xué)標(biāo)記物有待于進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)．③孕婦外周血中的胎兒DNA在出生缺陷產(chǎn)前診斷的應(yīng)用多局限于小樣本實(shí)驗(yàn)，將來(lái)還需要大樣本量的可行性研究，使胎兒DNA更適應(yīng)于臨床應(yīng)用．④目前研究的只是一小部分出生缺陷類(lèi)型，更多的由于環(huán)境、多基因等復(fù)雜因素引起的出生缺陷與游離胎兒DNA的關(guān)系有待深入地探索．⑤要突出胎兒DNA不同于血清學(xué)標(biāo)記物的特點(diǎn)，不僅要從量的變化中作出預(yù)測(cè)，還應(yīng)努力在基因水平上分析胎兒DNA．使其不僅可以作為預(yù)測(cè)指標(biāo)，更能成為診斷、監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的指標(biāo)．

[1]Simpson J L,Elias S.Isolating fetal cells from maternal blood.Advances in prenatal diagnosis through molecular technology[J].JAMA,1993,270:2357-2361.

[2]Lo Y M,Corbetta N,Chamberlain P F,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350(9076):485-487.

[3]Alberry M,Maddocks D,Jones M,et al.Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast[J].Prenat Diagn,2007,27(5):415-418.

[4]Wataganara T,Chen A Y,Leshane E S,et al.Cell-free fetal DNA levels in maternal plasma after elective first trimester termination of pregnancy[J].Fertil Steril,2004,81(3):638-644.

[5]Costa J M,Benachi A,Gautier E,et al.First-trimester fetal sex determination in maternal serum using real-time PCR[J].Prenat Diagn,2001,21(12):1070-1074.

[6]Chan K C A,Zhong J,HuiABY,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2004,50(1):88-92.

[7]Angert R M,LeShane E S,Lo Y M,et a1.Fetal cell-free plasma DNA concentrations in maternal blood are stable 24 hours after collection:analysis of first-and third-trimester samples[J].Clin Chem,2003,49:195-198.

[8]Zhang Y,Li Q,Hui N,et al.Effect of formaldehyde treatment on the recovery of cell-free fetal DNA from maternal plasma at different processing times[J].Clin Chim Acta,2008,397(1-2):60-64.

[9]Koide K,Sekizawa A,1wasaki M,et a1.Fragmentation of cell-free fetal DNA in plasma and urine of pregnant women[J].Prenat Diagn,2005,25:604-607.

[10]Bischoff F Z,Dang D X,Marquez-Do D,et al.Detecting fetal DNA from dried maternal blood spots:another step towardsbroad scale noninvasive prenatal genetic screening and feasible testing[J].Reprod Biomed Online,2003,6(3):349-351.

[11]Jimenez D F,Tarantal A F.Quantitative analysis of male DNA in maternal serum of gravid rhesus monkeys[J].Pediatr Res,2003,53(1):18-23.

[12]Khosrotehrani K,Wataganara T,Bianchi DW,et al.Fetal cell-free DNA circulates in the plasma of pregnant mice:relevance for animal models of fetomaternal trafficking[J].Hum Reprod,2004,19:2460-2464.

[13]Vodicka R,Vrtel R,Dusek L,et al.Refined fluorescent STR quantification of cell-free fetal DNA during pregnancy in physiological and Down syndrome fetuses[J].Prenat Diagn,2008,28(5):425-433.

[14]Dhallan R,Guo X,Emche,et al.A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood:a preliminary study[J].Lancet,2007,369(9560):474-481.

[15]Chim S S C,Tong Y K,Chiu R W K,et al.Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:14753-14758.

[16]Chan K C,Ding C,Gerovassili A,et al.Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma:A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis[J].Clin Chem,2006,52:2211-2218.

[17]Old R W,Crea F,Puszyk W,et al.Candidate epigenetic biomarkers for non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome[J].Reprod Biomed Online,2007,15(2):227-235.

[18]Christina F H,Blumenfeld Y J,Chitkara U,et al.From the Cover:Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J].Quake PNAS,2008,105:16266-16271.

[19]Sekizawa A,Farina A,Sugito Y,et a1.Proteinuria and hypertension are independent factors affecting fetal DNA values:a retrospective analysis of affected and unaffected patients[J].Clin Chem,2004,50:221-224.

[20]Yin A H,Ng E H Y,Zhang X Z,et a1.Correlation of maternal plasma total cell-free DNA and fetal DNA levels with short term outcome of first-trimester vaginal bleeding[J].Hum Reprod,2007,22:1736-1743.

[21]Picchiassi E,Coata G,Fanetti A,et a1.The best approach for early prediction of fetal gender by using free fetal DNA from maternal plasma[J].Prenat Diagn,2008,28(6):525-530.

[22]Muller S P,Bartels I,Stein W,et a1.The determination of the fetal D status from maternal plasma for decision making on Rh prophylaxis is feasible[J].Transfusion,2008,48(11):2292-2301.

[23]Lo Y M D,Lun F M F,Chan K C A,et al.From the Cover:Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104:13116-13121.

[24]Tong Y K,Ding C,Chiu R W K,et al.Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma:theoretical and empirical considerations[J].Clin Chem,2006,52:2194-2202.

[25]Aragones A B,Tiebas M J T,Merlo J G,et al.Prenatal diagnosis of Huntington disease in maternal plasma:direct and indirect study[J].Eur J Neurol,2008,15(12):1338-1344.

[26]Li Y,Naro E D,Vitucci A,et al.Detection of Paternally Inherited Fetal Point Mutations for β-Thalassemia Using Size-Fractionated Cell-Free DNA in Maternal Plasma[J].JAMA,2005,293:843-849.