CpG ODN誘導人PBMC增殖的體外實驗研究

李金龍,耿 力,韓 剛,賈明庫

(吉林大學第二醫院普通外科,吉林長春 130041)

CpG ODN誘導人PBMC增殖的體外實驗研究

李金龍,耿 力,韓 剛,賈明庫*

(吉林大學第二醫院普通外科,吉林長春 130041)

目的研究CpG ODN在體外刺激人PBMC的增殖情況。方法分別以腫瘤抗原(Ag)、白細胞介素-2(IL-2)和CpG ODN單獨或聯合刺激正常人和腫瘤患者PBMC,并對其增殖活性進行測定。結果以CpG ODN刺激人PBMC組的細胞增殖活性明顯高于對照組(P＜0.05)。結論CpG ODN、IL-2與腫瘤抗原共同刺激能有效提高人PBMC的增殖活性。

CpG ODN;人外周血單核細胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0037)

近年來腫瘤的生物治療研究較多,并取得了一定的療效與進步。CpG ODN具有激活宿主免疫系統的能力,可刺激機體活化對腫瘤的先天免疫并增強抗原遞呈細胞介導的獲得性免疫,在疫苗佐劑的設計以及抗腫瘤免疫治療中顯示出良好的應用前景[1]。本文通過觀察CpG ODN與IL-2、腫瘤凍融抗原共同刺激人PBMC在體外的增殖情況,為進一步進行相關腫瘤免疫治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 分別選取本院健康志愿者和結腸癌患者各5人進行采血20 ml,并在2 h內分離。

1.1.2 腫瘤細胞株、CpG2006和IL-2 人結腸癌細胞株SW1116購自吉林省腫瘤研究所;CpG 2006由上海生工生物技術服務公司合成;IL-2購自長生基因藥業股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的分離 每份血樣中加入等量生理鹽水混勻稀釋,離心。分離出離心分層后單個核細胞層,另加RPMI1640后離心,洗滌2次。計算活細胞百分數＞95%。

1.2.2 腫瘤抗原的制備 SW111細胞培養、傳代。細胞呈指數期生長時,調細胞濃度1×107/ml,共計8.8 ml。放入液氮中10 min,室溫融化,反復5次。4℃離心,收上清。同時將細胞沉淀溶于8.8 ml生理鹽水中,超聲細胞破碎儀破碎、離心,收上清。兩次離心收獲的上清混合,-80℃保存備用。

1.2.3 PBMC的增殖培養 抗原3倍稀釋使之濃度與外周血細胞數之比為1∶10,將CpG ODN與IL-2濃度分別調至100 μ g/ml和 1 000 U/ml。

1.2.4 實驗分組 (1)PBMC;(2)PBMC+Ag+IL-2;(3)PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN。

1.2.5 調PBMC細胞濃度為6×106/ml,接種于96孔板,每孔 50 μ l,每組 4復孔。其中PHA 10倍稀釋,每孔加 20 μ l。抗原、CpG-ODN 和 IL-2 均每孔加20 μ l。各組分別補加相應體積的IMDM 培養液至200 μ l/孔 。37℃、5%CO2培養72 h,收上清 ,-20℃保存備用。

1.2.6 實驗結果測定分兩組進行,分別測定CpGODN刺激PBMC3天、6天后PBMC增殖情況。在培養結束前4小時加入MTT(5 mg/ml)20 μ l/孔。培養結束離心,棄上清,各孔加入 150 μ l DMSO混勻,酶標儀492 nm波長測A值。

1.3 統計學處理

采用SPSS11.0軟件做方差分析和t檢驗。

2 結果

無論是在正常人組還是在腫瘤組,CpG組PBMC細胞增殖活性均明顯高于對照組(P＜0.05)。而腫瘤組與正常人組相比較,其PBMC增殖活性則無顯著性差異(表1、2)。

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測定(正常人組,±s,n=4)

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測定(正常人組,±s,n=4)

與PBMC空白對照組相比,*P＜0.05;與不加CpG的相應對照組相比,△P＜0.05

組別A 值(±s)培養3天 培養6天PBMC 0.231±0.006 0.383±0.066 PBMC+Ag+IL-2 0.298±0.003* 0.457±0.031 PBMC+CpG+Ag+IL-2 0.423±0.006*△ 0.691±0.005*△

3 討論

過繼免疫治療是近年來腫瘤治療的新方法之一,其基本原理是通過輸注自體或同種異體特異性或非特異性腫瘤殺傷細胞(主要為免疫活性細胞)而達到治療腫瘤的目的。1985年美國學者Rosenberg等創立IL-2+LAK細胞療法后,這種療法得到廣泛的重視,現已形成了先在體外激活和擴增殺傷腫瘤細胞的效應細胞,然后再回輸病人的這種程序[2]。腫瘤特異性CTL細胞取自患者自身的外周血淋巴細胞,在有腫瘤抗原及IL-2存在的條件下,在體外進行二次致敏和擴增。這種細胞特異性高,殺傷力強。但由于治療腫瘤時要求效應細胞與靶細胞比例保持在100-10/1,治療一次需要細胞較多,應用上受到一定的限制。

表2 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測定(腫瘤組,±s,n=4)

與PBMC空白對照組相比,*P＜0.05;與不加CpG的相應對照組相比,△P＜0.05

本實驗中應用的CpG2006為B型CpGODN,是由三磷酸核苷酸和多個未甲基化的CpG二核苷酸共同構成PTO骨架,并由PolyT間隔4個TCGT基序組成的24 bp的寡核苷酸片斷,為全硫代硫酸二酯鍵修飾,具有抵抗細胞內核酶降解作用的全程留待修飾的PS骨架(核苷酸的磷酸二酯鍵的游離氧原子被硫代修飾),這種骨架有力于加強對淋巴細胞的刺激作用。本研究發現應用全硫代的CpG 2006與IL-2、腫瘤凍融抗原共同刺激能有效的提高正常人和腫瘤病人的PBMC的增殖活性。實驗結果也證實CpG2006能有效地促進外周血單個核細胞的增殖,國外文獻亦有相同報導[3]。

[1]WeinerGJ,Liu H M,Wooldridge JE,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:10833.

[2]Rosenberg SA,Lotze MT,Yang JC,et al.Experience with the use of highdose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients[J].Ann Surg,1989,210:474.

[3]Gursel M,Verthelyi D,Klinman DM.CpG oligodeoxynucleotides induce human monocytes to mature into functional dendritic cells[J].Eur J Immunol,2002,32:2617.

The proliferation of human PBMC induced by CpG ODN in vitro

LI Jin-long,GENGLi,HAN Gang,et al.(The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveStudy the proliferation of human PBMC stimulated by CpG ODN in vitro.MethodsStimulate PBMCs of health adults and patientssuffered from cancer with tumor antigen,IL-2 or CpG ODN and determine their proliferative activity.ResultsThe cell proliferation activity of CpG ODN stimulating group is higher than the other groups(P＜0.05).ConclusionThe proliferative activity of human PBMC can be improved effectively with the stimulations of CpG ODN,IL-2 and tumor antigen together.

CpG ODN;PBMC;Proliferation

R730.54

A

1007-4287(2010)01-0037-02

吉林省科技廳資助項目(項目編號20050410-5)

*通訊作者

2008-12-24)