血鏈球菌對牙周炎主要致病菌拮抗作用機理研究

代雪茹,馬晟利,呂秋菊,孫 劍

(1.黑龍江省佳木斯大學,黑龍江佳木斯 154001;2.黑龍江省醫院 黑龍江 哈爾濱 150001;)

血鏈球菌對牙周炎主要致病菌拮抗作用機理研究

代雪茹1,馬晟利2*,呂秋菊1,孫 劍1

(1.黑龍江省佳木斯大學,黑龍江佳木斯 154001;2.黑龍江省醫院 黑龍江 哈爾濱 150001;)

*通訊作者

血鏈球菌是牙周優勢細菌,被認為是拮抗牙周可疑治病菌的主要有益菌[1,2]。在齦下菌斑的形成中有重要作用。血鏈球菌作為有益菌群成員之一,它對大多數牙周可疑致病菌,如牙齦卟啉單胞菌、伴放線桿菌等都具有抑制作用[1]。本實驗通過對wistar大鼠剝離牙齦及齦溝內接種牙齦卟啉單胞菌誘發牙周炎,將血鏈球菌培養的活菌體對牙齦卟啉單胞菌進行拮抗,并觀察其對牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性wistar大鼠45只,體重在220 g-260 g左右,購自佳木斯大學動物實驗室中心。

1.2 標準菌株

血鏈球菌ATCC 10556(由華西醫科大學衛生部口腔微生態重點實驗室提供);牙齦卟啉單胞菌ATCC 33 277(由首都醫科大學口腔基礎實驗室提供)。

1.3 wistar大鼠牙周炎模型建立

1.3.1 大鼠適應性喂養7天后,隨機分為2組。正常對照組15只,正常喂養,不作特殊處理;牙周炎組30只:在喂養中用10%的高糖水替代飲水,動物適應性喂養7天后,于第8天開始隔日給予大鼠左側上頜第一磨牙齦溝內接種牙齦卟啉單胞菌及牙齦剝離,直到建立模型成功。

1.3.2 結果判斷 通過臨床觀察、組織病理及牙齦卟啉單胞菌的檢測各項指標均能證明牙周炎模型的建立。

1.4 應用血鏈球菌培養活菌體對大鼠左側上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進行干預

1.4.1 實驗分組 將經檢測的Wistar大鼠隨機分為2組,并設立空白對照組。

1.4.2 空白對照組 對建模時對照組中的Wistar大鼠左側上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進行檢測,結果陰性者中隨機選取10只。飲食、飲水均正常。不加任何干預。每4天檢測一次,共檢測7次,其觀察牙齦卟啉單胞菌在大鼠口腔中的情況。

1.4.3 活菌體、PBS緩沖液組 對成功建模后的Wistar大鼠左側上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進行檢測,結果陰性者中隨機選取20只共分2組,各組10只,飲食、飲水均正常。從經檢測后開始,兩組每日分別給大鼠左側上頜第一磨牙牙頸部涂抹活菌體,PBS緩沖液。連續涂抹28天,每4天檢測一次,共檢測7次,其觀察牙齦卟啉單胞菌在大鼠口腔中的情況。

1.4.4 觀察指標 臨床觀察:觀察各組大鼠牙齦炎癥情況和X線片牙槽骨吸收及牙周情況。組織病理:各組分別在8周后處死大鼠,分離其上頜骨并截取磨牙段,10%甲醛固定48 h,脫鈣,切片和HE染色,觀察各組大鼠牙周組織病理變化。

2 結果

2.1 臨床觀察結果 對照組未發現牙齦紅腫及探針出血情況,X線片示牙槽骨十分致密,未見牙槽骨吸收;牙周炎組牙齦明顯紅腫,探針易出血,X線片顯示可見左側上頜第一磨牙垂直吸收,明顯可見牙槽骨吸收及根分歧處病變;PBS緩沖液組牙齦紅腫,探針易出血,X線明顯可見牙槽骨吸收及根分歧處病變情況;活菌體組牙齦紅腫及探針出血不明顯,左側上頜第一磨牙可見遠中牙槽骨吸收,根分歧處有不同程度的病變。

2.2 組織學觀察結果 對照組大鼠牙周組織結構正常,齦溝上皮、結合上皮完整無釘突,牙周膜纖維排列整齊,牙槽骨中未見破骨細胞;牙周炎組牙齦上皮增生,少量急性炎癥細胞及大量慢性炎癥細胞浸潤,牙周主纖維束斷裂,牙槽骨明顯吸收,結合上皮有釘突形成,牙周袋內有較多慢性炎癥細胞;PBS緩沖液組結合上皮中有大量炎性細胞浸潤,有深牙周袋形成,牙槽骨中可見破骨細胞,牙槽嵴及臨近牙周膜的牙槽骨吸收較明顯;活菌體組結合上皮中出現炎性細胞,牙周袋形成,牙槽嵴頂吸收,可見少量破骨細胞。

2.3 牙齦卟啉單胞菌的菌落數變化

2.3.1 建立牙周炎模型成功后對2組大鼠左側上頜第一磨牙牙頸部分別涂抹活菌體、PBS緩沖液連續28天,均4天檢測一次的整個觀察期內牙齦卟啉單胞菌菌落數變化情況,見表1。

表1 兩種培養方法不同時間點菌落數比較(cfu/ml)(±s)*

表1 兩種培養方法不同時間點菌落數比較(cfu/ml)(±s)*

*多變量分析結果表明四組菌落數有統計學差異,P＜0.05

組別時間(天)未涂菌 4 8 12 16 20 24 28 PBS 133.4±5.5 129.7±5.6 126.4±5.5 122.9±5.0 117.8±3.9 111.7±3.9 105.1±3.8 98.1±3.0活菌 137.9±7.7 132.2±6.5 120.9±6.1 110.5±4.4 98.6±6.2 86.9±4.6 73.6±5.1 55.2±5.9

2.3.2 將活菌體組與PBS培養組菌落數進行比較,可見在各個時間點活菌體組菌落數均少于PBS培養組的菌落數,隨著時間的推移可見明顯的差異。證明血鏈球菌的活菌體對牙齦卟啉單胞菌有拮抗作用。

3 討論

牙周病是一種細菌感染性疾病,大量的研究表明口腔微生態系不僅包括一些可疑的致病菌還包括許多牙周有益菌,有益菌與致病菌之間存在相互拮抗的生態關系,從而有利于保持或恢復牙周的健康狀態。血鏈球菌是口腔生態系的重要生理菌和牙周有益菌之一,在維持牙周生態平衡與健康中起重要作用。血鏈球菌對牙周可疑致病菌的拮抗作用在體外實驗和動物模型研究中得到初步證明。許多學者認為血鏈球菌能通過其分泌的過氧化氫及血鏈素拮抗牙周可疑致病菌[3,4]。此前眾多學者在進行血鏈球菌拮抗作用的體外研究主要應用Sabine法[5]進行。其結果表明血鏈球菌對牙齦卟啉單胞菌、中間普沃菌和具核梭桿菌的生長均有拮抗作用,其中對牙齦卟啉單胞菌的作用較強。

對血鏈球菌的深入研究是牙周病生態防治工作的重要內容,為探討血鏈球菌與牙周可疑致病菌的相互作用及進一步明確血鏈球菌拮抗牙周可疑致病菌的機理,本實驗將血鏈球菌培養的活菌體對牙齦卟啉單胞菌進行拮抗,并其觀察了血鏈球菌培養活菌體是否可以阻止或減少牙周可疑致病菌牙齦卟啉單胞菌的生長。研究結果表明血鏈球菌培養的活菌體對牙齦卟啉單胞菌的生長有拮抗作用,提示血鏈球菌產生的抑菌物質主要存在于菌細胞內,且活的菌細胞通過新陳代謝不斷地產生這類抑菌物質作用于周圍環境中其他細胞。關于血鏈球菌培養的活菌體能否在臨床上發揮作用以及能否將血鏈球菌的活菌體作為一種抗牙周病因子應用于牙周病的防治有待進一步研究。

[1]Hillman J D,Sm,ransky S S,ShiversM The relationships between streptococcal species and periodontopathic bacteria in human dental plaque[J].Arch Qral Biol,1985,30(11-1 2):791.

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[4]Lehree R I,RosemanM,Harwig S S,et al.Ultrasensitive assaysfor endogenous antimicrobial polypeptides[J].J Immun M,1991,137(2):167-173.

[5]Sabine D B.An antibiotic.1ike effect of lactobacillus acidophilus[J].Nature(London),1963,199:811.

1007-4287(2010)01-0126-02

黑龍江省自然科學基金項目(D2007-03)

2009-05-16)