Survivin在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

邢洪存 郭芳芳 盧振霞*

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升的趨勢。研究發現，腫瘤的發生可能由癌基因的激活、抑癌基因的失活引起，也可能是細胞凋亡異常的結果[1-4]。Survivin是迄今發現最強的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員[5,6]。研究表明，Survivin選擇性地表達于腫瘤組織，而在正常成熟組織中不表達或很少表達[7-9]。本研究旨在通過檢測Survivin在結直腸癌組織中的表達情況，探討其與結直腸癌發生、發展和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

標本取自2003年8月至2005年10月在吉林大學中日聯誼醫院及吉林省腫瘤醫院腹科住院行根治性手術的58例原發性結直腸癌患者。所有標本均經嚴格篩選及2名以上醫師進行病理診斷，術前均未經化療、放療或免疫治療。其中男性31例，女性27例。患者年齡34～79歲，中位年齡55.8歲。結腸癌24例，直腸癌34例。低分化癌35例，中高分化癌23例。有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移9例。Dukes A期1例，B期7例，C期37例，D期13例。全部患者在手術中均采集癌組織及癌旁正常組織標本（距腫瘤邊緣10cm處）各一塊，立即置于液氮中冷凍，然后轉移至-80℃低溫冰箱中保存用于實驗。

1.2 主要試劑

RNA提取及RT-PCR檢測試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物的設計及合成

根據GenBank中登錄的Survivin基因序列（NM_001168）設計一對引物，P1：5'-ATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTT-3'；P2：5'-TTCCT AAGACATTGCTAAGGGGC C-3'，擴增片段長度297bp。以β-actin為內對照，設計引物序列為：P1：5'- GGACCTGAC CGACT ACCTCA-3'；P2：5'- AATCCACATCTGCTGGAAGG-3'，擴增片段長度523 bp。均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 總RNA的提取

取冰凍組織50 mg切成薄片，用冷PBS洗滌后，按RNA抽提試劑盒說明抽提總RNA。經紫外分光光度計于260nm 和280nm波長下測定吸光度值，并行RNA 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳以檢測抽提純度及完整性。

1.5 Survivin基因的RT-PCR擴增

取1μg總RNA，以用Oligo（dT）為引物按反轉錄試劑盒說明在M-MLV作用下合成cDNA第一鏈。然后以反轉錄產物為模板，按下述程序進行PCR反應：94℃ 5min；95℃ 1min，55 ℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.6 統計學處理

應用SPSS 10.0 統計軟件對結果進行卡方檢驗，以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 Survivin基因mRNA在結直腸癌及癌旁正常組織中的轉錄水平

RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有標本中均有β-actin的穩定表達，說明實驗結果可靠（圖1）。結果顯示，58例結直腸癌標本中Survivin mRNA陽性表達39例，陽性率為67.2%，而癌旁正常組織標本中則無1例表達，兩者差別有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 Survivin 表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性

統計分析表明，結直腸癌組織中Survivin基因表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及組織學分化程度均無關（P＞0.05），而與Dukes分期及有無淋巴結轉移密切相關（P＜0.05），見表1。

表1 結直腸癌組織中Suvivin 表達水平與臨床病理特征的相關

3 討 論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發生和發展機制尚未完全闡明。目前的研究發現，腫瘤的凋亡抑制可能在結直腸癌的發生、發展中有重要的作用[3,4]。Survivin于1997年[5,6]被發現，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中分子量最小、抗凋亡作用最強的成員。研究報道，Survivin特異表達于人和鼠的胚胎發育組織以及多數人類腫瘤細胞，而在正常成人組織的表達僅見于胸腺、睪丸和分泌期子宮內膜[7-9]。它可能主要通過兩種方式抑制細胞凋亡[5,10,11]：一是通過其蛋白激酶結構域特異地結合caspase-3和caspase-7而直接阻斷細胞凋亡過程；二是競爭結合p21-Cdk4復合物上的Cdk4，使p21成為游離狀態，游離的p21與caspase-3結合后反饋抑制caspase-3的活性，間接阻止細胞凋亡。

目前，Survivin在結直腸癌組織中的表達還未取得統一認識[12-14]。本研究應用RT-PCR方法檢測了58例結直腸癌患者癌組織和癌旁正常組織中Survivin基因的表達情況，結果表明Survivin基因在58例結直腸癌組織中的陽性表達率為67.2%，而在癌旁正常組織中均不表達。提示Survivin與結直腸癌的發生有關，也可能在結直腸癌的演變過程中發揮重要作用。有研究發現，在腫瘤患者外周血的血清中提取到了Survivin抗體[15,16]，提示它可能作為一個較為普遍的腫瘤標志物用于結直腸癌及其他惡性腫瘤的早期診斷。但不無爭議，Gianani等[17]報道用免疫組織化學的方法在結直腸的正常、增生、癌前病變和癌組織中均能檢測到Survivin，只是表達程度不同，認為其不能作為腫瘤標志物。而學者Kawasaki等[18,19]則認為這種在大腸正常組織中不表達，而在腺瘤組織出現表達說明Survivin基因是在大腸癌發生早期階段（腺瘤階段）被激活并開始表達，可以認為Survivin的過度表達是結直腸上皮癌變過程的早期事件，其可作為腫瘤標志物。這方面的研究還在繼續深入，在今后的臨床工作中將著重這方面的研究。

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