三氧化二砷對MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化的影響

朱載華，孫莉，陳丹，張乾坤，嘉婷，鄒正平，朱小春

(溫州醫學院附屬第一醫院 風濕免疫科，浙江 溫州 325000)

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是常見的自身免疫性疾病，目前尚無根治方法，其發病機制尚未完全清楚，目前認為表觀遺傳學機制，特別是DNA甲基化在系統性紅斑狼瘡的發病機制中起了非常重要的作用。三氧化二砷（ATO）作為我國中藥砒霜的主要成分，在臨床上用于治療急性早幼粒細胞白血病取得一定療效[1]，且已有研究證實，ATO能下調MRL/lpr狼瘡小鼠FasL、IFN-γ、自身抗體、RF等水平，抑制淋巴組織增生、皮膚損害、肺和腎臟的炎性浸潤、腎臟的免疫復合物沉積并延長MRL/lpr狼瘡小鼠生存時間[2]。本課題組亦有研究證實ATO能降低BXSB小鼠血清中抗dsDNA水平，抑制腎小球中IgG的沉著，延長狼瘡鼠的生存時間[3]。鑒于DNA甲基化在SLE的發病機制中的重要作用及ATO對MRL/lpr狼瘡小鼠的治療作用，本研究將討論ATO對MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化水平的影響，從遺傳學的發病機制方面為ATO治療SLE提供重要的依據。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 ATO、5-氮雜胞苷（5-AzaC）和植物血凝素P（PHA-P）均為Sigma公司產品；白介素-2（IL-2）為上海華新生物高技術有限公司產品；RPMI 1640和胎牛血清（FCS）為Gibco公司產品；淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產品；Dynal Mouse CD4 Nega-tive Isolation Kit為挪威Dynal公司產品；流式相關的大鼠抗小鼠TH細胞IgG-FITC為eBioscience公司產品；基因組DNA小量抽提試劑盒和質粒小量抽提試劑盒均為碧云天生物技術有限公司產品；DNA 甲基化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒為ZYMO公司產品；PCR試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖（X-Gal）均為大連寶生物工程有限公司產品；PCR引物序列由上海基康生物有限公司合成；E.coli DH5α為本實驗室保存。

1.2 實驗動物 16～18周雌性MRL/lpr狼瘡小鼠，體重33～36 g；16～18周雌性C57BL/6J小鼠，體重25～30 g購自上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF級實驗動物房飼養。

1.3 細胞培養與處理 取雌性MRL/lpr狼瘡小鼠6只，雌性C57BL/6J小鼠8只，頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離脾臟，并采用密度梯度離心法自脾臟中分離小鼠單個核細胞，免疫磁珠法分選脾臟CD4+T細胞，流式細胞術（FACS）檢測細胞純度。用10%FCS1640將MRL/lpr小鼠淋巴脾臟CD4+T細胞濃度調整為1×106/mL，重懸于24孔板（1 mL/孔）。于37 ℃、5% CO2孵箱培養。各組細胞培養后均采用臺盼藍染色法測定細胞存活率。細胞存活率＝（染色陰性細胞數/細胞總數）×100%。各組均大于95%。體外經PHA-P（終濃度20μg/mL）和IL-2（終濃度1000 IU/mL）刺激48 h后隨機進行如下分組：①PBS組（n=9）：空白對照；②ATO組（n=9）：1μmol/L ATO作用24 h；③ATO+5-AzaC組（n=9）：1μmol/L 5-AzaC作用72 h后1μmol/L ATO作用24 h。

1.4 基因組DNA抽提及亞硫酸氫鹽修飾 收集各分組細胞懸液于Eppendorf管，離心后采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒抽提DNA，用貝克曼分光光度儀DU800檢測DNA純度，各組DNA OD260/OD280的范圍均在1.8至2.0之間。抽提得到的基因組DNA，采用ZYMO公司DNA甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾。DNA經亞硫酸氫鹽修飾后，CpG島中的非甲基化胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），經PCR擴增后轉變為胸腺嘧啶（T）；而CpG島中的甲基化胞嘧啶（mC）仍保留為胞嘧啶（C）。CpG島以外序列中的胞嘧啶（C）均轉變為尿嘧啶（U），經PCR擴增后均為胸腺嘧啶（T）。

1.5 PCR擴增IFN-γ基因啟動子、DNA凝膠回收、克隆、轉化及測序 以亞硫酸氫鹽修飾的基因組DNA為模板，采用巢式PCR進行擴增，PCR引物序列參照文獻[4]，即外部引物：5’-GGTGTGAAGTAAAAGT GTTTTTAGAGAATTTTAT，3’-CAATAACAACCAAAAACAA CCATAAAAAAAAACT；內部引物：5’-TAGAGAATTTTATAA GAATGGTATAGGTGGGTAT，3’-CCATAAAAAAAAAC TACAAAACCAAAATACAATA。總反應體系50μL：10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 4μL、上下游引物（20 pmol/mL）各0.5μL、Takara Taq 0.25μL、樣本DNA 1μL、去離子水38.75μL，采用降落PCR擴增，退火溫度先從59 ℃到52 ℃，每2個循環下降1 ℃，再50 ℃擴增30個循環。擴增后的DNA用2%瓊脂糖膠進行分離，采用ZYMO公司DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA。回收的DNA和pMD-19T載體16 ℃連接30 min，按文獻[5]制備感受態細胞E.coli DH5α，連接物轉染細胞，均勻涂布于含有X-Gal、IPTG和氨芐西林（Amp）的LB-瓊脂平板培養基上37 ℃培養過夜。從LB平板上挑取單個白色菌落，接種入LB液體培養基中，37 ℃震蕩培養過夜。取菌液，采用碧云天質粒小量抽提試劑盒抽提質粒。質粒抽提初步電泳鑒定后送上海英駿生物技術服務有限公司測序。

1.6 測序結果分析 采用基于網絡的在線生物信息學工具QUMA[6]分析測序結果。IFN-γ基因啟動子平均甲基化率=（啟動子區甲基化的CpG個數/啟動子區總CpG個數）×100%。

1.7 統計學處理方法 兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用校正t檢驗，多組間比較采用方差分析，方差不齊時采用Dunnett’s t3檢驗。

2 結果

采用CpG對平均甲基化程度來評估啟動子甲基化水平。IFN-γ啟動子區包含6個CpG位點，MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子CpG位點分布及各不同藥物處理組甲基化狀態見圖1，圖2為測序圖，截取圖1中各組中第一個克隆為代表。PBS組MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子平均甲基化水平低于C57BL/6J小鼠，差異有顯著性（平均甲基化率0.074±0.121 vs 0.639±0.245，P=0.001）。MRL/lpr小鼠CD4+T細胞ATO處理組平均甲基化水平上升，與PBS空白對照組差異有顯著性（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.074±0.121，P=0.044）；ATO+5-AzaC組的甲基化水平上升，與PBS空白對照組差異有顯著性（平均甲基化率0.482±0.386 vs 0.074±0.324，P=0.038）；ATO組與ATO+5-AzaC組的甲基化水平差異無顯著性（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.482±0.386，P=0.959）（見圖3）。

圖1 亞硫酸氫鹽修飾的MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化分析，圓圈代表CpG位點，●表示甲基化狀態，○表示非甲基化狀態

圖2 MRL/lpr小鼠CD4+T細胞各不同藥物處理組的測序圖，取各組中第一個克隆為代表，**為CpG位點標志

圖3 MRL/lpr小鼠CD4+T細胞不同藥物處理組的IFN-γ基因啟動子甲基化水平（n=9，F=4.736，*P<0.05）

3 討論

SLE患者T細胞DNA呈低甲基化水平，其基因組DNA甲基化程度為1%，低于正常人的2.5%～4.5%，且SLE患者T細胞DNA甲基化酶（DNMT）的活性僅為正常人的1/3～1/2[7]。甲基化抑制劑如5-AzaC處理鼠或人克隆CD4+T細胞后，能改變基因的表達，誘發狼瘡樣綜合征[8]，提示T細胞DNA低甲基化可能在SLE發病中起重要的作用。Bird等[9-11]報道，導致IFN-γ基因轉錄表達量增加的主要機制是IFN-γ基因啟動子低甲基化。用亞硫酸氫鹽測序法顯示人和小鼠T細胞中IFN-γ基因啟動子區域均有5～7個CpG對，這些位點的甲基化狀態與IFN-γ轉錄翻譯水平呈負相關。

Fas基因隱性突變的MRL/lpr小鼠作為常用的SLE動物模型之一，其出現與人類SLE類似的自身免疫綜合征，發病期DNA甲基化水平明顯下降，DNA甲基轉移酶1（Dnmt1）表達明顯下降[12-14]。本實驗中PBS組MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子平均甲基化率為0.074±0.121，相對于正常對照C57BL/6J小鼠PBS組的0.639±0.245，顯示明顯去甲基化，與Mizugaki等[13]的研究相一致，進一步驗證了DNA低甲基化和狼瘡的發病具有一定的相關性。

本課題組體外實驗[15]已證實1μmol/L濃度ATO作用24 h，能夠逆轉MRL/lpr狼瘡小鼠CD4+T細胞活化狀態下IFN-γ分泌和轉錄水平的異常高表達，但其機制尚不清楚。研究表明砷劑能通過改變DNA甲基化水平來影響、調控著某些基因的轉錄，Chanda等發現砷劑能引起p53和p16基因啟動子的高甲基化，其甲基化程度與砷的劑量呈正相關。故本實驗假設ATO通過促進CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子的甲基化，從而抑制其基因的表達。已有實驗證實ATO能提高MRL/lpr小鼠的脾臟與淋巴結DNA整體甲基化水平[16]，但只是間接說明ATO抑制T細胞IFN-γ的轉錄可能是通過DNA甲基化途經來調控，本實驗則直接測定MRL/lpr狼瘡小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化率來證實上述的假設。本實驗結果顯示ATO處理的MRL/lpr小鼠CD4+T細胞平均甲基化水平與空白對照組相比有明顯的上升（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.074±0.121，P=0.044），加入甲基化特異性抑制劑5-AzaC，ATO仍然能促進MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子的甲基化（平均甲基化率0.482±0.386 vs 0.074±0.324，P=0.038），進一步肯定了ATO促進CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子的甲基化的作用。

綜上所述，MRL/lpr小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子呈低甲基化水平，1μmol/L ATO作用24 h能提高活化狀態下以及5-AzaC預處理后的MRL/lpr小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化水平。但是ATO是否通過DNMT與DNA去甲基化酶（dMTase）相互作用，從而影響甲基化水平，尚未清楚，這是我們下一步研究的重點。

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