納米銀對海參腐敗中優勢菌種的抑制作用

李新林, 段續, 張慜

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

納米銀對海參腐敗中優勢菌種的抑制作用

李新林, 段續, 張慜＊

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

目前常用的海參干燥方法為水發和鹽發,但是此類方法所得海參品質極低。現在為得到高品質海參產品,多采用真空冷凍干燥,但是真空冷凍干燥時間較長,微生物難于控制。采用液相化學還原法制備納米銀,然后將海參腐敗過程中優勢菌進行分離純化,研究了納米銀對海參腐敗中優勢菌,以及海參中所有菌的抑制作用。結果表明,濃度在中華人民共和國國家標準-生活飲用水衛生標準最大允許量(0.05 mg/L)以下的納米銀與海參腐敗中優勢菌株,或海參腐敗中所有菌作用12h后,能殺滅80%左右的細菌。

納米銀;優勢菌;分離純化;殺菌

目前納米技術和納米銀材料的科學價值和應用前景已逐漸被人們認識,納米材料的制備已經逐漸完善[1]。一些納米材料的制備技術已經相當成熟,開始走向工業化生產,許多商品化的納米產品已經被應用到了許多領域[2-3]。納米銀既具有納米材料的異于普通材料的光,電,磁,熱,力,機械等性能特性,又具有銀本身的一些特性:廣譜抗菌、殺菌效率高、不易產生抗藥性、安全性高等特點,另外,銀粒子的抗菌作用有持續性,銀粒子在殺滅細菌,從細菌中滲出后還可以繼續作用于其他細胞[4-5]。因此,含銀或銀離子的抗菌劑已經成為商品化無機抗菌劑研究的重要方向[6]。

海參(Sea Cucumber)屬棘皮動物門、海參綱、盾手目動物[7]。全世界已知的海參有1 100多種,其中可食用海參40多種。海參是不含膽固醇的動物性食品,且其體內含有豐富的生理活性物質,具有極高的營養價值[8]。海參的高營養,高蛋白,使得其極易滋生微生物而腐敗,另外海參離開海水后還會因為自身酶作用而發生自溶,所以新鮮海參的保藏極其困難,目前市場上出售的海參多為水發或鹽發產品,此類海參產品的生理活性物質及其他營養物質基本消失殆盡[9]。為得到高品質海參產品,現在多采用真空冷凍干燥,但是真空冷凍干燥時間較長,微生物難于控制。因此,納米銀用于海參加工具有非常大的現實意義和應用前景。

目前,納米銀抗菌劑被廣泛應用到建筑材料、陶瓷制品及纖維、塑料、涂料、醫療衛生等諸多領域[10]。在食品行業中關于納米銀的報道多為保鮮膜的研制,而作為食品防腐劑直接添加到食品上的研究[11],納米銀涂膜技術的研究都比較少。中華人民共和國國家標準-生活飲用水衛生標準(GB 5749—2006)中規定,飲用水中銀的含量不得超過0.05 mg/L,將納米銀配成質量濃度在0.05 mg/L以下的水溶液,然后在海參真空冷凍干燥前進行納米銀涂膜,可以很好的抑制海參真空冷凍干燥過程中的微生物生長。本文采用液相化學還原法配制納米銀溶膠[12-13],然后研究了質量濃度為0.045 mg/L納米銀水溶液對海參腐敗時所有菌及優勢菌的抑制作用,為納米銀涂膜技術提供理論依據,也為納米銀在食品加工,貯藏保鮮等方面的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鮮海參:江蘇無錫朝陽市場購買;營養瓊脂(生化試劑)、氯化鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、次亞磷酸鈉、六篇磷酸鈉、堿性復紅、番紅、結晶紫、草酸銨、碘、碘化鉀、甲醛、孔雀綠、丙酮、黑素、石碳酸、單寧酸、FeCl3·6H2O等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SPX型智能生化培養箱:南京實驗儀器廠制造;101-1-BS型干燥箱:上海躍進醫療器械廠制造; SW-CJ-LB型無菌操作臺:蘇凈集團安泰公司制造; ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫療器械廠生產;HJ-3恒溫磁力攪拌器:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產;Nano-Zs90型納米粒度及Zeta電位分析儀:英國Malvern公司生產;UV-2102PCS型紫外可見分光光度計:尤尼科(上海)有限公司生產;KFLOW型純水機:凱佛隆公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米銀制備

1)硝酸銀溶液配制:稱取1.70 g AgNO3溶于20 mL超純水中配成Ag+溶液,在47℃水浴中預熱。

2)還原液的配制:分別稱取1.20 g NaH2PO2·H2O、0.25 g六偏磷酸鈉、2.70 gPVP,混合后溶于125 mL超純水中,攪拌使其完全溶解,然后移入500 mL的三角瓶中,加入2.5 mL H2SO4(c=1.0 mol/L)。

3)將還原液置于恒溫磁力攪拌器上高速攪拌,溫度調至47℃,然后將Ag+溶液移入分液漏斗,以1.5～2.5滴/s的速度加入到還原液中。

4)滴加完成后,在繼續高速攪拌60～90 min,即得到墨綠色(偏黑)納米銀溶膠。

5)中華人民共和國國家標準-生活飲用水衛生標準(GB 5749—2006)中規定,飲用水中銀的含量不得超過0.05 mg/L,為避免海參涂膜后銀含量超標,將納米銀用無菌超純水配制成濃度為0.045 mg/L的納米銀水溶液。以下所有實驗中所用納米銀水溶液濃度均為0.045 mg/L。

1.3.2 納米銀的表征

1)紫外-可見分光光度法:取合適濃度的納米銀進行紫外-可見分光光度計全波掃描。

2)納米粒度分析:取合適濃度的納米銀進行粒徑分析儀分析。

1.3.3 優勢菌種的分離純化及其基本生物學特征鑒定

1)優勢菌種的分離純化 ①海參的變質:將買得的冷凍鮮海參溫水解凍,置于干凈燒杯內,杯底留有少許水分,水分體積約占海參體積1/3,放置在25℃生化培養箱中3～5d,當燒杯內海參80%腐敗成糊狀時取樣。②涂布:稱取25 g腐爛成糊狀的海參于500 mL干凈滅菌三角瓶內,加入0.85%滅菌生理鹽水225 mL,分振蕩使之均勻,然后系列稀釋至合適濃度,再取合適濃度的細菌稀釋液0.2mL涂布平板。待菌液涼干后置于生化培養箱內培養,溫度37℃,培養48 h。③計數與劃線:涂布平板培養48h后,將平板上菌落分類計數,確定優勢菌菌落,然后挑取的優勢菌單菌落劃線。將劃線平板置于生化培養箱內培養,溫度37℃,培養24h.④保種:挑取劃線平板上單菌落,接種于斜面培養基,置于生化培養箱內培養,溫度37℃,培養24 h.然后置于4℃冰箱保存備用。

2)優勢菌種基本生物學特征鑒定 ①簡單染色:先將細菌制片,然后用堿性復紅染色液染色,最后鏡檢。②革蘭氏染色:首先將細菌制片,然后染色,染色過程是細菌先經結晶紫著色,然后用媒染劑碘液處理,再用酒精脫色,最后用番紅復染。待所有完成后鏡檢。③細菌芽孢染色:細菌先用石碳酸復紅液著色,然后制片,再用丙酮酒精脫色,最后用5%的孔雀綠復染。待所有完成后鏡檢。④細胞莢膜染色:首先制片,然后用石碳酸復紅液著色,再用Dorner黑素液均勻涂布載玻片,最后鏡檢。⑤細菌鞭毛染色:先將細菌菌液在載玻片上制成2～3條菌液帶,然后用費氏及康氏鞭毛染色液A染色,傾去A液,加費氏及康氏鞭毛染色液B液染色10 min,然后用齊氏石碳酸復紅染色,晾干后鏡檢。

1.3.4 納米銀溶液對不同稀釋度菌液的殺菌效果

1)取不同稀釋度的細菌稀釋液與相同體積濃度為0.045 mg/L納米銀水溶液作用相同時間

2)然后各取1 mL細菌納米銀混合液澆注平板,待平板凝固后置于生化培養箱內培養,溫度37℃,48 h觀察結果。

1.3.5 作用時間與納米銀殺菌效果的關系

1)取合適稀釋度的細菌稀釋液與濃度為0.045 mg/L的納米銀水溶液作用,時間分別為0 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h,同時用無菌水與細菌稀釋液作用為對照。

2)作用到規定時間后澆注平板,待平板凝固后置于生化培養箱內培養,溫度37℃,48 h觀察結果。

1.3.6 納米銀對海參腐敗中所有菌的殺菌效果

1)同1.3.2中2)方法獲得合適濃度細菌稀釋液,然后取合適稀釋度的細菌稀釋液各1 mL于9 mL質量濃度為0.045 mg/L的納米銀水溶液中,得到納米銀溶液稀釋的細菌菌液,作用12 h。對照為各取1 mL相應濃度的細菌稀釋液于9 mL無菌水中。

2)12 h后取合適稀釋度的細菌稀釋液各1 mL澆注平板,每一稀釋度做2個平行。待平板凝固后置于生化培養箱內培養,溫度37℃,48 h觀察結果。

1.3.7 納米銀分別對海參腐敗中優勢單菌株的殺菌效果

1)將斜面培養基上的菌株挑出,劃線,置于生化培養箱內培養,溫度37℃,培養24 h.

2)挑取劃線平板上單菌落于1 mL生理鹽水中,系列稀釋至合適濃度。

3)取合適稀釋度的細菌稀釋液各1 mL分別加入9 mL濃度為0.045 mg/L的納米銀水溶液中,作用12 h。對照為各取1 mL細菌稀釋液于9 mL無菌水中。

4)取合適稀釋度的細菌稀釋液各1 mL澆注平板,每一稀釋度做2個平行。然后置于生化培養箱內培養,溫度37℃,48 h后觀察結果。

2 結果與討論

2.1 納米銀表征結果

2.1.1 納米銀溶液的紫外-可見吸收光譜 圖1顯示最大吸收峰在400 nm,與文獻報道過的納米銀溶膠吸收峰相近。吸收峰的位置隨粒徑的增大而向長波移動。這種紅移現象與納米銀和其周圍介質的介電常數的差值有關,絕對差值越大,紅移越大。

2.1.2 納米銀的粒度分布 粒度分析儀結果見圖1～3。圖2最高吸收峰為42.25 nm,粒子平均直徑為65.34 nm。圖3最高吸收峰為47.29 nm,粒子平均直徑為67.77 nm。納米銀溶膠靜置7d后,顏色、亮度都沒有變化,也沒有有沉淀產生,從圖中可以看出,納米銀溶膠在放置7 d后,納米銀粒子直徑也基本沒有變化。放置更長時間后,納米銀溶膠的顏色、亮度和沉淀情況都沒有明顯變化,預計納米銀的粒子直徑也變化不大,此方法所得納米銀溶膠的穩定性很好。

圖1 納米銀溶液的紫外可見光譜Fig.1 Typical UV-VIS absorption spectrum of the solution of silver nanoparticles

圖2 靜置1d后的納米銀微粒粒度分布圖Fig.2 Size distribution of silver nanoparticles on the first day

圖3 靜置7d后納米銀微粒粒度分布圖Fig.3 Distribution of silver nanoparticle size on the seventh day

2.2 優勢菌種分離純化及其基本生物學特征鑒定

2.2.1 優勢菌種分離純化 海參腐爛是由多種細菌共同作用的結果。海參腐爛過程中細菌數目最多的菌株為優勢菌種,納米銀如果對海參腐敗時優勢菌種的有很好的抑制作用,那么也從側面反應了納米銀在海參涂膜中的抑菌作用。海參腐敗過程中優勢菌種分離純化結果見表1,其中稀釋度為1010。

從表1可以看出,菌1,菌2總數目占細菌總數的80%以上,這兩種細菌在海參腐敗過程中數目最多,是腐敗時的優勢菌種。這些細菌的菌落形態見表2。

表1 海參腐敗過程中優勢菌種分離純化結果Tab.1 Results of separating of the ascendant bacterium from the putrid sea cucumber

表2 優勢菌菌落形態Tab.2 The form of colony of the ascendant bacterium

2.2.2 優勢菌種基本生物學特征 菌1:球型;革蘭氏陽性;無芽孢;有莢膜;無鞭毛。菌2:桿狀;革蘭氏陰性;無芽孢;無莢膜;無鞭毛。

2.3 菌液與納米銀最適體積比的測定結果

我國國家標準-生活飲用水衛生標準中規定銀的含量不能超過0.05 mg/L,實驗中所用納米銀濃度為0.045 mg/L,為確定在此濃度下,納米銀與菌液的最適體積比,把相同體積的納米銀與不同濃度的細菌稀釋液作用。作用結果見表3。

表3 菌液與納米銀溶液最適體積比測定結果Tab.3 The optimum volume ratio of bacterium and silver nanoparticles

表3中106,107,108為一定濃度的菌液與納米銀水溶液混合后,菌液的最終稀釋度,在稀釋度為107時,殺菌率為(276-54)×107/276×107× 100%=80.4%,在稀釋度為108時,殺菌率為(47-5)×108/47×108×100%=89.3%。由此可見,納米銀相對菌液的體積越大,殺菌效果越好,但是國標-菌落總數測定中規定計數取每個平板上菌落數目在30～300的計數,所以在確保平板上菌落數目在30以上時,納米銀相對菌液還未飽和,在確保每平板菌落數目在30以上的基礎上納米銀相對菌液體積越大,殺菌效果越好。

2.4 納米銀溶液對不同稀釋度菌液的殺菌效果

為確定在0.045 mg/L濃度下,納米銀殺菌的最適作用時間,現取稀釋了1010的海參腐敗時所有菌菌液與相同體積的納米銀水溶液作用,作用至相應的時間后,再澆注平板,菌落計數。作用時間分別為0 min、30 min、1、3、6、12、24 h。結果見圖4。從圖中可以看出,作用開始至12 h內,菌落數目下降較快,作用從12 h至24 h內,落落數目降低很少,由此可見,此濃度下的納米銀與菌液的最適作用時間為12 h左右。

實驗中用無菌水做對照的目的是排除滲透壓對細菌死亡率的影響。濃度為0.045 mg/L納米銀水溶液中有高分子的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和一些其他無機離子的存在,其滲透壓一定比用去離子水滅菌所得無菌水的滲透壓大,因此在不清楚納米銀水溶液滲透壓具體值的條件下,用無菌水做對照,參照對照算出的殺菌率更加真實。

圖4 作用時間與納米銀殺菌效果的關系Fig.4 Relation of reaction time andeffect of silver nanoparticles

2.5 納米銀對腐敗海參中細菌的殺菌效果

2.5.1 納米銀對腐敗海參中所有菌的總體殺菌效果 納米銀與腐敗海參中所有菌作用12 h結果見表4。從表4中可以看出納米銀的抑菌效果為(500×1010-69×1010)/500×1010×100%= 86.2%,納米銀對所有菌的總體殺菌效果明顯,為納米銀涂膜提供了理論依據。

表4 納米銀與腐敗海參中所有菌作用12 h結果Tab.1 Result of sterilizing of silver nanoparticles to all bacterium in the sea cucumber with 12h

2.5.2 納米銀對海參腐敗中優勢菌的作用效果納米銀與海參腐敗中優勢菌單菌株作用,排除了其他因素的干擾,更真實的反應了納米銀的殺菌能力。納米銀與海參腐敗中優勢菌菌種1和菌種2的作用結果見表5和表6。

表5 納米銀與優勢菌種菌1作用12 h結果Tab.5 Result of sterilizing of silver nanoparticles to bacteria-1 with 12h

表6 納米銀與優勢菌種菌1作用12h結果Tab.6 The result of sterilizing of silver nanoparticles to bacteria-1 with 12h

從表5可以看出納米銀對菌1的殺菌效果為(870-205)/870×100%=76.4%。從表6看出納米銀對菌2的殺菌效果為(1 260-234)/1 260× 100%=81.4%。納米銀對海參中分離出的兩種優勢菌種的作用效果都在80%左右。菌種的不同,殺菌效果有一定的差異,但是總體而言,納米銀對海參腐敗時的細菌有很好的抑制作用。

3 結 語

1)液相化學還原法制得的納米銀尺度較小,平均粒徑為65 nm左右,且分布范圍狹窄,分散性好,而且實驗條件要求不高,這個方法不適為實驗室制備納米銀的好方法。

2)海參腐敗時,優勢菌種主要有兩種,這兩種菌大約占總菌數的80%。

3)納米銀與菌液的最適作用時間為12 h,再延長作用時間殺菌效果變化不大。

4)質量濃度為0.045 mg/L的納米銀與菌液作用,在確保平板上菌落數目在30以上時,納米銀相對菌液還未飽和,因此,在確保每平板菌落數目在30以上的基礎上納米銀相對菌液體積越大,殺菌效果越好。

5)納米銀與海參腐敗時所有細菌,及其中的優勢菌種作用,殺菌效果在80%左右。

6)需進一步研究的問題:納米銀涂膜與其他殺菌技術相結合,確保海參在真空冷凍干燥過程中微生物安全,以及最終產品的保質期。

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(責任編輯:楊萌)

Study on the Preparation and Sterilization of Silver Nanoparticles to the Ascendent Bacterium Within the Putrid Sea Cucumber

LI Xin-lin, DUAN Xu, ZHANG Min＊
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In order to overcome the shortcomings of the methods including water-drying,saltdrying and vacuum freeze-drying,this study firstly prepared the silver nanoparticles by chemical reduction in liquid phase,than separated the corruption bacteria from the sea cucumber,.Based on the above results,the sterilizing effect of the silver nanoparticles on the corruption bacteria and on the all microorganisms in the putrid sea cucumber were carefully investigated.It was demonstrated that 0.05 mg/L silver nanoparticles can efficiently sterilize 80%bacterium after 12 h treatment.

silver nanoparticles,ascendent bacterium,separating,sterilization

TS 205

:A

1673-1689(2010)03-0359-06

2008-12-15

國家863計劃項目(2006AA09Z430)。

＊通信作者:張慜(1962-)男,浙江平湖人,工學博士,教授,博士生導師.主要從事農產品加工研究。Email:min @jiangnan.edu.cn