一株他克莫司產生菌的篩選及鑒定

李玲, 陳林, 楊文革, 管珺, 胡永紅

(南京工業大學制藥與生命科學學院,南京 210009)

一株他克莫司產生菌的篩選及鑒定

李玲, 陳林, 楊文革, 管珺, 胡永紅＊

(南京工業大學制藥與生命科學學院,南京 210009)

添加75μg/mL K2Cr2O7和2μg/mL青霉素對土樣進行預處理,采用抑菌圈法初篩得到71株能抑制白色假絲酵母生長的菌株,高效液相色譜法檢測代謝產物復篩,獲得一株他克莫司產生菌株。對菌株形態學特征、培養特征、生理生化特征、細胞化學組分和16S rDNA序列進行分析。結果表明:NJ YH2618為革蘭氏陽性菌,生長溫度15～38℃,最適生長溫度28℃,生長p H 6.5～8.5,最適p H 7.0,能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、果糖、乳糖、鼠李糖等常見碳源。細胞水解產物成分和16S rDNA序列分析表明,此菌株屬鏈霉菌屬,命名為Streptomycessp.NJ YH2618。

他克莫司;鑒定;鏈霉菌;16S rDNA

他克莫司(tacrolimus),是一種大環內酯類免疫抑制劑[1]。1984年首次由日本藤澤制藥從筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensisNo.9993)的發酵培養基中發現[2],之后國內外進行了他克莫司的基礎和臨床研究,1993年4月正式確認了其在“抑制肝臟移植排斥反應”方面所具有的作用和療效,同年5月正式投放國際市場。他克莫司與環孢菌素的作用機制相似,具有高效低毒、副作用小等優點。除了在抑制器官移植排斥反應方面具有顯著療效外,還廣泛應用于斑禿、牛皮癬、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞氏病、變應性皮炎、類風濕性關節炎以及多發性硬化病等自身免疫疾病的治療[3]。

作者從不同地區的土壤中分離得到一株他克莫司產生菌,通過對其形態特征、培養特征、生理生化特征、細胞化學組分以及16S rDNA序列進行分析,確定其為鏈霉菌。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣來源 土樣采集自南京、海南、合肥等地。

1.1.2 指示菌 抗菌活性測定所用指示菌為白色假絲酵母(Candida albicansA TCC10231),購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 主要試劑和儀器 他克莫司標準品:購自Sigma公司;其他試劑:均為化學純和分析純,色譜分析所用試劑:色譜純;高效液相色譜儀:DIONEX P680購自美國戴安公司制造;CX-31電子顯微鏡:購自日本奧林巴斯株式會社制造;Fresco離心機:購自Heraeus公司;PCR儀:購自Eppendorf公司; PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱:購自上海躍進醫療器械廠;HYG-IIa迥轉式恒溫調速搖瓶柜:購自上海欣蕊自動化設備有限公司。

1.1.4 培養基

1)高氏一號培養基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g,MgSO4· 7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂粉20 g,水1 000 mL,p H 7.0。

2)PDA培養基:去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,水1 000 mL,p H自然。

以上培養基于1.01×105Pa高壓下,121℃蒸氣滅菌15～20 min。

1.2 菌株分離和培養

將采集的土樣室溫風干,用研缽研碎,60目篩子過篩,添加75μg/mL K2Cr2O7和2μg/mL青霉素,混合均勻后于120℃干熱1 h[4],冷卻備用。分離時選用高氏一號培養基。取一定量處理后的土樣平鋪于滅過菌的光滑硬紙板上,紙面積略大于培養皿的口徑,將多余的土輕輕傾去,見紙板上有一層細土粒粘附即可。接種時將倒好培養基的皿蓋微微揭開,將土壤紙板粘土面向下輕輕插入并覆蓋其上,用皿蓋微微觸動一下紙板并立刻抽出,蓋好皿蓋即接種完畢。28℃恒溫培養7 d,挑取菌落大、氣生菌絲豐茂的單個菌落于發酵培養基(高氏一號)中,28℃、200 r/min培養5 d。將發酵液離心(室溫8 000 r/min離心10 min),取上清液,進行代謝產物抗菌活性測定。

1.3 初篩——代謝產物抗菌活性檢驗

將篩選菌發酵液上清液與PDA培養基混合,配成不同質量濃度的發酵液培養基,倒入直徑9 cm的消毒培養皿中,制成平板,同時離心空白發酵培養基,將上清液和無菌水代替發酵上清液作為對照。將培養2 d的白色假絲酵母菌塊(d=0.6～0.8 cm)接入平板中央;也可取0.1 mL篩選菌發酵液于PDA培養基平板上,用三角涂布棒涂布均勻,直接將假絲酵母菌塊接入平板中央,有菌的一面朝下[5]。接種后置恒溫培養箱中28℃培養,每隔24 h按十字交叉法測量菌落直徑,觀察菌落顏色、生長情況、菌核有無生成等。

1.4 復篩——代謝產物的鑒定

將初篩得到的具有抑菌活性的菌株搖瓶培養,將甲醇和發酵液按1∶1的比例混合,搖勻,振蕩10 min,12 000 r/min離心20 min,取上清液作為待測樣品。高效液相色譜(HPLC)條件:高效液相色譜儀DIONEX P680,色譜柱Kromasil C18(4.6 mm× 250 mm,5μm),流動相為V異丙醇∶V水=35∶65,流速為1.0 mL/min,柱溫50℃,檢測波長220 nm。將初篩菌株代謝產物的HPLC圖譜與標準品圖譜進行比較分析,確定代謝產物的種類[6]。

1.5 形態特征

采用插片法觀察[7],菌株置于高氏一號培養基平板上,28℃培養7 d,用顯微鏡觀察并描述菌株的形態特征。

1.6 培養特征

在28℃,以6種常用的培養基培養7～12 d[8],觀察菌株基內菌絲和氣生菌絲在各種培養基上的形態特征、有無可溶性色素產生及生長狀況等。

1.7 生理生化特征

參照文獻[9],測定菌株的生理生化特征。

1.8 細胞化學成分分析

采用薄層板層析法(TCL)[10],對菌株的細胞進行全細胞水解液的氨基酸和糖型分析。

1.9 16S rDNA序列分析及其系統發育分析

DNA提取參照文獻[11],采用通用引物Pf(5′-A GAGTTTGA TCATGGCTCAG-3′)和Pr(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rD-NA的PCR擴增[12]。PCR反應條件:94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸1 min 40 s,共32個循環。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后,回收條帶送寶生物工程(大連)有限公司測序。將該序列通過BLAST程序與GenBank中的核酸數據進行對比分析,利用ClustalX(Version1.8)和MEGA2.0軟件進行多序列比對及系統發育樹構建,明確菌株NJ YH2618的分類地位。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離、篩選

放線菌的培養時間較長,篩選時比較容易被細菌、真菌和霉菌干擾而不易篩出。為降低雜菌干擾,作者通過對土樣120℃干熱1 h,添加75μg/ mL K2Cr2O7和2μg/mL青霉素進行預處理。從土樣中初篩得到31株對白色假絲酵母(Candida albicans)有抑制作用的菌株,對這31株菌的代謝產物進行高效液相分析,通過與標準品圖譜(保留時間10.560 min)比較,發酵液HPLC圖譜中10.787 min的圖譜峰極可能是他克莫司,由此獲得一株他克莫司產生菌NJ YH2618,見圖1。

由式(6)可知，等式右邊的電流對應臨界換相時間面積，等式左邊對應換相電壓時間面積。若換相電壓時間面積在換相線電壓變為負時還沒達到臨界換相時間面積，此時換相尚未結束而閥側電壓變為正向，換相角無法求解。因此不發生換相失敗的前提是換相角可以求解，且換相結束之后換流閥足以恢復阻斷能力，即滿足式(10)。

圖1 他克莫司標準品(a)和NJYH2618發酵液HPLC圖譜(b)Fig.1 HPLC profile of tacrolimus standardandfermentation broth of the strain NJYH2618

2.2 形態觀察

此菌株為革蘭氏陽性菌,高氏一號瓊脂培養基上28℃培養8 d。從圖2可以看出:菌落正面為青灰色,反面為暗黃色,菌落干燥,不透明,表面形狀褶皺,菌落與培養基連接緊密,難以挑取。采用插片法,在光學顯微鏡下觀察(放大400倍),基內菌絲發育良好,無橫隔,不斷裂;氣生菌絲生長良好,多分枝,孢子絲直或柔曲。

圖2 菌株NJYH2618的菌落及菌絲形態(400×)Fig.2 Morphological characteristics ofthestrainNJYH2618(400×)

2.3 培養特征和生理生化特征

表1為菌株NJ YH2618在不同培養基上的生長情況,其中在PDA培養基上生長良好,氣生菌絲青灰色,基內菌絲黃褐色,有黃褐色色素產生。

生理生化實驗結果見表2,菌株NJ YH2618能使明膠液化,牛奶胨化,淀粉水解;不能使牛奶凝固;該菌能在15～38℃范圍內生長,最適生長溫度28℃;p H生長范圍為6.5～8.5,最適p H 7.0;能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、果糖、乳糖、鼠李糖等常見碳源。

表1 菌株NJYH2618的培養特征Tab.1 Cultural properties of strain NJYH2618

表2 菌株NJYH2618的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical properties of strain NJYH2618 agar block method

菌株NJ YH2618全細胞水解產物中含LDAP、甘氨酸和天冬氨酸等氨基酸,含葡萄糖、半乳糖和核糖等糖類。這些特征與鏈霉菌屬特征相符合,命名為Streptomycessp.NJ YH2618。

2.5 16S rDNA序列分析及其系統發育分析

對NJ YH2618菌株的16S rDNA的擴增片段進行測序,長度為1 433 bp,登錄GenBank(Accession number:FJ842651),用Blast進行同源性分析,發現菌株NJ YH2618與鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株高度相關,說明該菌株屬鏈霉菌屬。選取同源性最高(99%)的11株菌株,利用ClustalX (Version1.8)和MEGA2.0軟件進行多序列比對及系統發育樹構建,用Neighbor-Join法得到系統進化發育樹見圖3。在系統發育樹中,NJ YH2618和Streptomyces albonigerNBRC12738,Streptomyces moderatusNBRC 13432聚為一簇。到目前為止,已報導的他克莫司產生菌有以下4種[13-15]:Streptomyces tsukubaensis,Streptomyces kanamyceticus,Streptomyces glaucescens和Streptomyces clavuligerus,NJ YH2618在進化樹中的位置與這4株菌不同。

3 結 語

作者利用平板初篩、搖瓶復篩,從土壤中篩選了一株他克莫司產生菌株,經鑒定該菌株為鏈霉菌Streptomycessp.NJ YH2618。通過對其形態特征、培養特征、生理生化特性以及16S rDNA序列進行分析,確定其分類地位。迄今為止,中國關于發酵法產他克莫司的研究較少,尚未有工業化的報道,關于此菌株的研究工作正在進行中。抗生素發酵除受營養因素的限制以外,合適的發酵條件也是不可忽視的重要因素。今后的工作可以考慮從以下幾個方面展開:對他克莫司發酵條件中一些主要影響因素進行分析;優化產物的分離提純工藝;對菌株代謝過程進行研究,明確發酵培養基中各成分的利用情況與菌絲生長和發酵液活性之間的關系,從而有效地提高他克莫司產量。

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(責任編輯:李春麗)

Isolation and Identification of a Tacrolimus Producing Strain

LI Ling, CHEN Lin, YANG Wen-ge, GUAN Jun, HU Yong-hong＊
(College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China)

In order to isolate a tacrolimus producing strain,soil samples were initially treated with 75μg/mL K2Cr2O7and 2μg/mL benzylpenicillin.Seventy-one actinomycetes were isolated by anti-fungal activity againstCandida albicansthen the metabolites origin from those isolations were further analysis by HPLC.Among these,only one tacrolimus producing strain was determined.Itwasidentifiedbyculturecharacteristics,morphologicalcharacteristics, physiological,biochemical properties and 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis.The screened strain was gram-positive,the growth temperature ranged from 15℃to 38℃(the optimum was 28℃);the growth p H ranged from 6.5 to 8.5(the optimum at 7.0).The strain can grown on glucose,sucrose,maltose,xylose,fructose,lactose and rhamnose.Based on the results of the general taxonomical characteristics and the 16S rDNA sequence,the isolated has proven to beStreptomycesand namedStreptomycessp.NJ YH2618.

tacrolimus,identification,Streptomyces,16S rDNA

Q 939

:A

1673-1689(2010)03-0416-05

2009-03-26

國家863計劃項目(2007AA02Z211)。

＊通訊作者:胡永紅(1968-),女,江蘇南通人,工學博士,教授,博士生導師,主要從事發酵工程、酶工程及生物分離工程方面的研究。Email:hyh@njut.edu.cn。