木質素與半纖維素對稻草秸稈酶解的影響

孫萬里, 陶文沂

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江西省宜春學院化學與生物工程學院,江西宜春 336000)

木質素與半纖維素對稻草秸稈酶解的影響

孫萬里1,2, 陶文沂＊1

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江西省宜春學院化學與生物工程學院,江西宜春 336000)

分別采用稀酸和酸堿順序兩種方法處理稻草秸稈,20 FPU/g(底物干重)的纖維素酶、底物質量濃度為80 g/L,45℃酶解72 h。結果表明,木質素與半纖維素對纖維素轉化為葡萄糖都有較大影響,稀酸處理的秸稈酶解纖維素轉化率(43.4%,葡萄糖質量濃度24.1 g/L)是未處理秸稈(16.8%,葡萄糖質量濃度6.2 g/L)的2.6倍,而酸堿順序處理的秸稈(60.6%,葡萄糖質量濃度47.7 g/L)則是未處理秸稈的3.6倍。采用上述兩種方法處理秸稈后,秸稈木質素和半纖維素被移去,秸稈結構發生改變,從而秸稈纖維更易受纖維素酶的攻擊,并且秸稈木質素和半纖維素質量分數越低,纖維素的酶解得率就越高。

預處理;水解;稻草秸稈;纖維素;半纖維素;木質素

木質纖維原料在生物煉制成清潔燃料或化學品的過程中,由于原料中纖維素、半纖維素和木質素致密復雜的結構,纖維素很難被酶水解成可發酵性糖,木質纖維原料在酶解成可發酵性糖前必須進行預處理以脫去木質素或在一定程度上改變原料的物理化學結構,如降低結晶度、減小聚合度、增加孔隙度和表面積等,以促進酶與底物相互接觸并反應,提高酶解速率和葡萄糖得率[1-2]。稀酸預處理是木質纖維材料最常用的方法之一,可去除木質纖維材料的半纖維素并增加纖維素酶對木質纖維的接觸面積[3-4];堿處理對連接半纖維素和其它組分的分子間酯鍵起到皂化作用,能脹潤木質纖維材料,有效地去除木質素,進而提高纖維素轉化率[5-6]。

作者采用稀酸和酸堿順序兩種方法處理稻草秸稈,然后進行酶解,以考察木質素和半纖維素對稻草秸稈酶解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

稻草秸稈:取自江蘇無錫,粉碎,過16目篩,水洗,65℃烘至恒重,室溫貯存備用。纖維素酶,江蘇無錫杰仁公司;其它試劑均為分析純。

1.2 秸稈預處理

1.2.1 稀酸處理 取粉碎后的秸稈100 g,按液固比10∶1的比例加入質量濃度為15 g/L H2SO4,攪拌均勻,于121℃處理1 h。抽濾,收集濾液,殘渣水洗至中性,65℃烘至恒重,稱重備用。

1.2.2 酸堿順序處理 稀酸處理同上,取稀酸處理過秸稈100 g,按液固比8∶1的比例加入質量濃度為20 g/L NaOH攪拌均勻,于121℃處理30 min。殘渣水洗至中性,65℃烘至恒重,稱重備用。

1.3 秸稈纖維組分的測定

纖維素用硝酸乙醇法測定;木質素用72%硫酸法測定;半纖維素用雙溴法測定[7]。

1.4 纖維素酶的測定

量取酶液0.5 mL,加入1.5 mL濃度為0.05 mol/L、p H 4.8的檸檬酸緩沖液和50 mg定量濾紙條,于50℃水浴準確保溫30 min,然后加入1.5 mL的DNS,煮沸5 min,冷卻后用蒸餾水定容到20 mL,在波長540 nm處測定所得還原糖質量濃度[8]。一個濾紙酶活力國際單位等于酶促反應中每分鐘生成1μmol葡萄糖(以還原糖表示)所需的酶量。

1.5 酶水解反應

稱取4.0 g處理過的底物,加入0.05 mol/L、p H 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,使底物質量濃度為80 g/L。纖維素酶20 FPU/g底物(干重), NOVO ZYME 188β-葡萄糖酶12 CBIU/g底物,于45℃水浴振蕩器內反應72 h,定時取樣,過濾,濾液經適當稀釋后進行還原糖與單糖分析。

1.6 水解液單糖測定

樣品液于10 000 r/min條件下高速離心10 min,上清液經0.45μm微孔濾膜過濾后進樣測定,外標法定量。色譜條件為:高效液相色譜儀,美國Agilent公司Agilent 1100 Series;示差折光檢測器,美國HP公司RI Detecotor HP1047A;分析柱, kromasil NH2(4.6 mm×250 mm,5μm)氨基柱,柱溫30℃,流動相:V乙腈∶V水=80∶20,流速1 mL/min,進樣量10μL。

1.7 纖維素轉化率

2 結果與分析

2.1 稻草秸稈處理前后組成的變化

稻草秸稈經過酸堿處理后成分變化見表1。秸稈在質量濃度為15 g/L,稀硫酸121℃處理1 h后,纖維素質量分數從41.5%上升到62.5%;在此基礎上再經過質量濃度20 g/L氫氧化鈉121℃處理30 min后,纖維素質量分數達到88.5%,但從表中也可看到,酸堿順序處理纖維素的質量損失也較大,達11.32 g(相當于原料初質量的1/4多)。與此同時秸稈原料中的纖維素與半纖維素大部分都被去除。

2.2 稻草秸稈的酶水解

圖1表示稻草秸稈在經過酸堿處理后的酶水解過程,從表1,圖1可看出,稻草秸稈在經過稀酸和稀堿順序處理后,木質素與半纖維素質量分數都很低,酶解后葡萄糖質量濃度最高,為47.7 g/L。與此相對應,未處理秸稈酶解后葡萄糖質量濃度很低。這些結果表明,秸稈原料的化學組成——木質素和半纖維素對纖維素酶解起到一定的阻礙作用。從稀酸處理的結果可以看出,盡管在稀酸處理后木質素質量分數增加,但半纖維素的脫除有助于纖維素酶對底物纖維素的接觸從而有助于纖維素的水解[4],葡萄糖質量濃度和纖維素的轉化率都比未處理的秸稈要高。在酸處理后接著進行堿處理,半纖維素與木質素大部分被去除,葡萄糖質量濃度與纖維素轉化率比稀酸處理高,葡萄糖最高質量濃度為47.7 g/L,纖維素轉化率為60.6%,它們分別是稀酸處理秸稈葡萄糖質量濃度的2倍和纖維素轉化率的1.4倍,是未處理秸稈的7.7倍和3.6倍。從這些結果可看出,稻草秸稈半纖維素與木質素質量分數越低,越有利于酶解。Mansfield等認為木質纖維材料對微生物酶攻擊有一定的抗性,但在去除木質素和半纖維素后,其纖維結構發生變化、表面積變大,增加了酶的接觸面積和可及性[9],因此在去除木質素和半纖維素之前,木質纖維酶解效率很低。對其它木質纖維材料如牛糞[10]、稻殼[11]、玉米秸稈[12]、甘蔗渣[13]等的研究也得到這個結論。Liao等認為半纖維素和木質素在物理和化學結構上阻礙酶對纖維素的水解[10]。去除這兩個成分時,纖維素結晶度減少、纖維材料多孔性和表面積增加,進而有助于酶水解[2,10,14]。

表1 未處理秸稈,稀酸處理和酸堿順序處理后秸稈化學組成Tab.1 Chemical composition of rice straw in the original form(untreated),after the dilute acid pretreatment and after a sequence of dilute acid and dilute alkali pretreatment

圖1 3種不同底物的酶解進程Fig.1 Time courses of enzymatic of rice straw with different pretreatments

而Pan等認為,木質素主要是形成物理屏障,阻礙纖維素酶對纖維素的接觸和木質素無效地吸收纖維素酶[15]。木質素會不可逆吸收纖維素酶,阻止纖維素酶對纖維素的作用[9],因此含木質素高的底物在水解時,由于纖維素酶被木質素吸咐,只有一部分纖維素酶能接觸到纖維素表面,纖維素水解率較低;而木質素質量分數低的材料則相反。

木質素是限制纖維素酶解的主要因素之一[16],研究證明,半纖維素對木質纖維材料的酶解也會起到阻礙作用,當半纖維素從稻草秸稈被脫除75.7%,木質素脫除率僅12.1%時,纖維素轉化率比未處理的轉化率提高2.6倍,為43.4%,相關的研究也證實,木質纖維材料經過酸處理后提高了酶解得率[4]。另外,經過稀酸或酸堿順序處理的稻草秸稈在酶解最初階段都有一個快速降解的對數期,見圖1。酸堿順序處理時酶解對數期更大,特別在最初的12 h,出現這種現象的原因主要是酶解時纖維素酶快速降解底物易接觸的無定形組分,而隨著酶解的推進,由于纖維素結晶度增加的原因,纖維素越來越能抵抗酶的水解[17-19]。

2.3 秸稈預處理前后的形態

經過預處理的木質纖維材料酶解得率得到較大的提高,可能是由于預處理改變了木質纖維材料的結構和溶解部分木質素和半纖維素,導致了底物對酶的可及性增加[19],進而有利于酶的作用。圖2是經過稀酸以及酸堿順序處理的稻草秸稈和未處理秸稈的掃描電鏡圖,秸稈處理后的結構變化證實了上述結論。可以看出,未處理的秸稈表面粗糙且高度有序(圖2a),稀酸處理后半纖維素得到大部分去除,秸稈表面較為光滑,其結構得到一定程度的修飾,但主要的結構并沒有打斷(圖2c)。當木質素被去除后,秸稈表面形態發生了很大的變化,秸稈纖維表面很光滑且成較薄的片狀(圖2e),從而增加了其與酶接觸的表面積,在酶解時更易受到酶的攻擊。將上述3種材料酶解,發現未處理的秸稈結構幾乎沒發生變化(圖2b),與其很低的纖維素轉化率相一致。當稀酸處理的秸稈酶解后纖維材料得到較大的變化(圖2d),纖維素轉化率也較高。而酸堿順序處理的材料經酶解后,纖維材料完全打斷(圖2f),這也部分解釋了處理后的底物能獲得更高質量濃度的葡萄糖和纖維素轉化率。

圖3 3種不同底物電鏡掃描圖Fig.3 Scanning electronic microscopy(SEM)of rice straw with different pretreatments

3 結 語

前人的研究表明,酸處理主要去除半纖維素[3-4],堿處理主要去除木質素[5]。為了提高木質纖維材料中的纖維素質量分數和酶解時纖維素的轉化率,選用稀酸稀堿來處理稻草秸稈以除去所含的木質素和半纖維素(酸處理后的半維素水解液含大量木糖和少量葡萄糖,可利用)。本實驗中,秸稈經稀酸處理后,半纖維素質量分數降低,木質素質量分數相對增加(纖維素、半纖維素、木質素和其它組成的部分溶解),處理后的秸稈經酶解后比未處理的秸稈纖維素轉化率高,為43.4%;秸稈稀酸再用稀堿處理,木質素和半纖維素質量分數大大降低,處理后的秸稈經過酶解,纖維素轉化率提高很大,為60.6%。從這些結果可得出,由于木質素與半纖維素的去除,導致木質纖維材料結構發生變化,表面積變大,增加了酶的接觸面積和可及性,從而秸稈越易酶解,相應的葡萄糖轉化率就越高。

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(責任編輯:李春麗)

Effect of Lignin and Hemicellulose on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose from Rice Straw

SUN Wan-li1,2, TAO Wei-yi＊1
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan Uinversity,Wuxi 214122,China;
2.College of Chemistry and Bioengineering,Yichun University,Yichun 336000,China)

In this manuscript,the enzymatic hydrolysis of rice straw in three different forms: original(untreated),pretreated by dilute acid,and pretreated by a sequence of dilute acid and dilute alkali,were studied.The hydrolysis was carried out in an enzyme/substrate ratio of 20 FPU/g,8%(w/v)substrate concentration,45℃for 72 h.The digestibility results suggested that the cellulose hydrolysis was greatly affected by the presence of hemicellulose and/or lignin in the rice straw.The cellulose conversion ratio 43.4%from dilute acid-treated rice straw was 2.6 times higher than that 16.8%from untreated rice straw,whereas from dilute acid and alkali rice straw such value was higher 3.6 times(60.6%).This result was probably due to the fact that the strong modification in the material structure caused by the hemicellulose and lignin removal from the rice straw.As a consequence,the cellulose fibers were separated being more susceptible to the enzymatic attack.It was concluded that the lower the hemicellulose and lignin in the rice straw,the higher efficiency of cellulose hydrolysis could be achieved at.

pretreatment,enzymatic hydrolysis,rice straw,cellulose,hemicellulose,lignin

TQ 35

:A

1673-1689(2010)01-0018-05

2009-05-09

國家科技支撐計劃重點項目(2008BAI63B06)。

孫萬里(1967-),男,江西修水人,發酵工程博士研究生。

＊通訊作者:陶文沂(1946-),男,江蘇無錫人,工學博士,教授,博士生導師,主要從事微生物工程和生物制藥方面的研究。Email:wytao1946@163.com