沙棘多糖HRPⅠa純化及鑒定

田曉艷, 劉延吉, 祝寰宇, 張弘, 劉沛含

(1.遼寧石油化工大學環境與生物工程學院,遼寧撫順 113001;2.沈陽農業大學生物科學技術學院,遼寧沈陽 110161)

沙棘多糖HRPⅠa純化及鑒定

田曉艷1, 劉延吉＊2, 祝寰宇2, 張弘1, 劉沛含1

(1.遼寧石油化工大學環境與生物工程學院,遼寧撫順 113001;2.沈陽農業大學生物科學技術學院,遼寧沈陽 110161)

作者研究了沙棘多糖Ⅰ(Hippophae rhamnoidesL.polysaccharideⅠ,HRPⅠ)的組成。采用DEAE-SephadexA-50凝膠柱對粗提多糖進行分離,酶法對HRPⅠ脫蛋白后,Sephadex-G150層析對HRPⅠ多糖進一步提純,HPLC層析確定HRPⅠa組成及組分比例,利用紅外光譜鑒定多糖HRPⅠa糖苷鍵。采用DEAE-SephadexA-50凝膠柱分離多糖,得到2種組分分別為HRPⅠa、HRPⅠb。HPLC檢測HRPⅠa水解物由木糖、甘露糖、葡萄糖組成,并且它們之間的摩爾比值為1∶1.06∶1.13。紅外光譜確定多糖HRPⅠa構型同時含有α和β-型糖苷。

沙棘;多糖;純化;鑒定

沙棘(Hippophae rhamnoidesL)為胡頹子科植物,沙棘果實中的活性成分已達到190多種,油中的活性成分有106種,其中脂溶性維生素有6種,脂肪酸22種,脂類42種,黃酮和酚類36種。沙棘黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗菌、抗病毒及增強免疫等廣泛的功效。沙棘多糖(HRP)有較強的抗氧化作用,還對引起病毒性心肌炎的病毒具有明顯的抑制作用。黃曉青等采用沙棘果榨汁提油后的果渣及籽渣提取的兩種沙棘多糖為材料,通過沙棘多糖對小鼠實驗性高脂血癥的影響,觀察其降血脂作用。證明沙棘多糖具有降低血清LDL-C,降低肝臟TC和高脂飲食引起的血糖升高,降低SGOT活性,保持肝臟功能。

目前對多糖生物學功效的研究愈來愈引起人們重視,成為當代生物學的熱門領域。但目前尚無對沙棘多糖提取純化的報道,作者對沙棘多糖HRPⅠa進行純化和鑒定,為沙棘多糖開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘多糖由沈陽農業大學生物科學技術學院提供。

1.2 方法

1.2.1 沙棘多糖HRP的醇沉及部分理化性質測定 分別選取體積分數0～50%、50%～70%、70%～90%乙醇沉淀沙棘多糖,并對各沙棘多糖部分理化性質進行測定。

1.2.2 沙棘多糖HRPⅠ脫蛋白及透析 用木瓜蛋白酶法脫蛋白,并將脫蛋白質多糖裝入活化好的透析袋中,流水透析48 h,蒸餾水透析72 h,不斷換水,然后進行濃縮、醇沉、洗滌、真空干燥,得到半純品多糖HRPⅠ。

1.2.3 粗多糖的分級純化 將粗提得到的多糖HRPⅠ過DEAE-SephadexA-50凝膠柱,用去離子水及0.01～0.1 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。

1.2.4 Sephadex-G150層析檢驗HRPⅠa多糖純度 HRPⅠa高效液相色譜(HPLC)分析及HRPⅠa紅外光譜檢測。

2 結果與分析

2.1 沙棘多糖HRP的醇沉及其部分理化性質

體積分數0～50%乙醇沉淀得高相對分子質量多糖(HRPⅠ,88.5%);體積分數50%～70%乙醇沉淀得中等相對分子質量多糖(HRPⅡ,5.5%);體積分數70%～90%乙醇沉淀得相對分子質量較小的多糖及低聚糖(HRPⅢ,6.0%)。選取含量較高的HRPⅠ作為后續研究對象。由于HRPⅠ具有考馬斯亮藍G-250反應,說明HRPⅠ中含有蛋白質組分,故要對其脫蛋白質。

表1 HRP I、HRP II、HRP III部分理化性質Tab.1 Part of physicochemical property of HRP I、HRP II、HRP III

2.2 HRPⅠ脫蛋白

經過L9(34)正交實驗,并用級差分析法來分析數據,得木瓜蛋白酶法脫蛋白質最佳條件:酶量5 mg/mL,酶解溫度60℃,p H=6,且此條件下的蛋白質清除率為73.58%。

2.3 HRPⅠ分離——DEAE-SephadexA-50柱層析

沙棘多糖的DEAE-SephadexA-50凝膠柱層析洗脫曲線如圖1。流速為0.5 mL/min,得兩個單一對稱洗脫峰,分別是1～20的水洗部分及0.05 mol/L NaCl洗脫部分;在0.01 mol/L NaCl及0.1 mol/L NaCl洗脫部分未見有多糖被檢出。因此將以上水洗部分及0.05 mol/L NaCl洗脫部分分別收集,透析,冷凍干燥后得到乳白色絮狀晶體及淡黃色絮狀晶體,分別命名為亞組分HRPⅠa、HRPⅠb。通過苯酚-硫酸法檢測,HRPIa、HRPIb的多糖得率分別為35.7%、8.5%,因此選擇多糖得率較高的亞組分HRP I a做純度檢測及進一步研究。

圖1 沙棘半精品多糖(HRPI)DEAE-SephadexA-50凝膠柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of HRPI on DEAE-SephadexA-50 column

2.4 HRPⅠa純化——sephadexG-150柱層析

HRP Ia過Sephadex G-150柱,經苯酚硫酸法跟蹤檢測洗脫曲線為單一對稱峰(見圖2),由此說明HRPIa是相對分子質量分布均一的沙棘多糖亞組分。

圖2 HRPIa的SephadexG-150凝膠柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of HRPIa on Sephadex G-150 column

圖3和圖4分別為標準單糖和HRPⅠa水解物的HPLC圖譜。水解液出峰的保留時間分別與標準樣中的木糖、甘露糖、葡萄糖相對應,說明AKSP2中含有這3種單糖,其摩爾量比值為1∶1.06∶1.13。

2.5 HRPⅠa紅外光譜檢測結果

多糖HRPⅠa在400～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜,主要強吸收峰為2 933.8,1 383.9 cm-1處的兩組峰。分別是糖類的伸縮振動及C—H變角振動,這兩組峰是糖類物質重要的特征吸收峰。在1 746.1 cm-1處及1 622.1 cm-1處的吸收峰,系C=O伸縮振動引起的,說明HRPIa可能含有—COOH,—CHO等基團,且—CHO等基團具有還原性,這可能與多糖的抗氧化性有關。在1 327.4 cm-1處的吸收峰,系C=O對稱伸縮振動引起的,說明HRP Ia中含有—COO結構;1 250～950 cm-1之間的幾組峰,是吡喃糖環的醚鍵(C—O—C)和羥基的吸收峰;在916.3 cm-1處的吸收峰說明其含有β-D-半乳吡喃糖;在760 cm-1附近的吸收峰說明其含有α-D-木吡喃糖;在843～818 cm-1附近的吸收峰說明其含有α-D-甘露吡喃糖、β-D-甘露吡喃糖,以上幾組峰說明HRP Ia既有α糖苷鍵又有β糖苷鍵。

圖3 標準單糖高效液相圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of standard monosaccharides

圖4 HRPⅠa水解物的高效液相圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of hydrolysates of HRPⅠa

3 結 語

采用DEAE-SephadexA-50凝膠柱對多糖分離,得到2種組分,即HRPⅠa、HRPⅠb。HPLC層析表明HRPⅠa由木糖、甘露糖、葡萄糖組成,且其摩爾比值為1∶1.06∶1.13。對多糖HRPⅠa在400～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜分析表明,鍵型為α和β-型糖苷鍵。

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(責任編輯:朱明)

Purification,Identification of Polysaccharide HRPⅠa of Hippophae rhamnoidesL.

TIAN Xiao-yan1, LIU Yan-Ji＊2, ZHU Huan-Yu2, ZHAN G Hong1, LIU Pei-han1
(1.College of Environmental Technology and Biotechnology,Liaoning University of Petroleum&Chemical Technology, Fushun 113001,China;2.College of Biotechnology,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110161,China)

The polysaccharide composition fromHippophae rhamnoidesL.polysaccharideⅠ(HRPⅠ)was study in this manuscript.Two different compositions,HRPⅠa,HRPⅠb were found in the isolated crude polysaccharide by DEAE-Sephadex-50 column the compositions of HRPⅠa contained xylose,mannose,glucose in 1∶1.06∶1.13 molar ratio.Furthermore,HRPⅠa configuration is composed ofαandβ-glycoside.

Hippophae rhamnoidesL.,polysaccharide,purification,identification

Q 539

:A

1673-1689(2010)01-0023-04

2009-01-09

國家863計劃項目(2004AA247010)。

田曉艷(1971-),女,遼寧沈陽人,講師,農學碩士,主要從事次生物質代謝研究。Email:maggietian2002@163.com

＊通訊作者:劉延吉(1959-),男,遼寧大連人,副教授,農學博士,主要從事細胞信號轉導研究。Email:yanjiliu@yahoo.com.cn