內蒙古鄂爾多斯地區酸粥發酵液中乳酸菌的分離鑒定

王煒宏, 杜曉華, 張家超, 于潔, 劉文俊, 孫天松, 張和平

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

內蒙古鄂爾多斯地區酸粥發酵液中乳酸菌的分離鑒定

王煒宏, 杜曉華, 張家超, 于潔, 劉文俊, 孫天松, 張和平＊

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

對采集自內蒙古鄂爾多斯地區的6份酸粥發酵液中的乳酸菌進行了分離、鑒定和生物學特性研究。采用15,30,45℃3個分離溫度共分離出18株乳酸菌。通過16S rRNA序列分析等研究將這些菌株鑒定為L actobacillus(L.)casei8株,L.plantarum2株,L.brevis3株,L.f ermentum1株,L.helveticus4株。分析認為L.casei是鄂爾多斯地區酸粥發酵液中的優勢菌群。對30℃分離株進行傳統生化鑒定,結果與16S rRNA序列分析結果一致。

乳酸菌;分離;鑒定;16S rRNA序列分析

酸粥是內蒙古西部地區一種傳統民間特色發酵食品[1],采用自然發酵法制成。這種獨特的生產方式較好地保存了當地自然環境的有益微生物(主要是乳酸菌),并賦予產品以獨特的風味。糜米經過發酵液發酵后炯飯或煮粥,米粒晶亮醇香,味如酸奶,筋軟爽口,有消暑、開胃作用。作者以制作酸粥的發酵液作為實驗對象,分離鑒定出其中的優勢乳酸菌,并對其生物學特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2008年8月采集自內蒙古鄂爾多斯地區的酸粥發酵液樣品6份。

1.1.2 參考菌株L actobacillus acidophilusATCC4356和L.dellbrueckii subsp.bulgaricusJCM1002,由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

1.1.3 培養基與試劑 MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基、TPY液體培養基、BLB液體培養基、10%脫脂乳培養基、糖類發酵基礎培養基等,參照文獻[2-4]制備。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 吸取100μL樣品接種于5 mL滅菌脫脂乳培養基中增菌培養后,挑取少量培養物劃線接種于含有10μg/g放線菌酮的MRS瓊脂培養基上,置于BBL厭氧培養罐中,分別于15,30,45℃厭氧培養48～72 h,觀察并記錄菌落形態。挑取單個菌落接種于MRS液體培養基中,在各自分離溫度下培養24 h后,顯微鏡中仔細觀察記錄革蘭氏染色細胞形態特征,同時進行過氧化氫酶實驗。將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株暫定為乳酸菌[5-6],并進一步純化培養保存。

1.2.2 乳酸菌生化特性試驗與糖發酵試驗 選取30℃下分離純化好的6株乳酸菌,參照文獻[4]和小崎等編著的乳酸菌鑒定手冊[6],進行包括溫度試驗、耐酸耐鹽試驗、葡萄糖產氣試驗等在內的生化試驗和糖發酵試驗對其進行鑒定。參照文獻[2-3,5,7]將這6株乳酸菌進行初步的種群歸類。

1.2.3 乳酸菌基因組DNA提取及16S rRNA測序 將純化好的菌株接種于5 mL無菌MRS液體培養基中,于各自分離溫度下培養24 h,連續培養3代后采用CTAB法提取總DNA[8]。并利用PCR擴增其16S rRNA基因片段。擴增引物采用通用引物[9-10],正向引物為27F:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;反向引物為1495R:5′-CTA CGG CTA CCT TCT TAC GA-3′。

PCR反應體系(25μL)的配制:上下游引物各1μL(10μmol/μL),模板DNA 1μL(50 ng/μL),10 ×PCR Buffer 2.5μL,dNTP MIX 2μL,超純水17.2μL,rTaq酶0.3μL。

PCR擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,循環30次;72℃延伸10 min,4℃保溫。

PCR產物用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測,片段長度約1 500 bp的陽性產物經純化后送上海桑尼生物技術有限公司進行測序。所得序列運用DNAstart軟件進行序列拼接和校準排齊,然后用于系統進化分析和種屬鑒定。

1.2.4 16S rRNA系統進化分析和種屬鑒定 得到的序列在GenBank數據庫中進行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對,并利用本地軟件Mega 4.0與模式菌種進行系統進化親緣關系研究。利用軟件中的cluster W構建系統進化發育樹,以同源性大于99%為種的分界閾值將待測菌株鑒定到種。所得菌株16S rRNA序列全部提交GenBank數據庫。

2 結果與分析

2.1 菌株分離

采集自內蒙古鄂爾多斯地區的酸粥發酵液樣品6份,經分離純化,結合革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗,共分離出18株乳酸菌,全部為桿菌。其中15℃分出7株,30℃6株,45℃5株。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 乳桿菌生化鑒定結果 以L actobacillus acidophilusATCC4356和L.dellbrueckii subsp.bulgaricusJCM1002為參考菌株,對6株30℃分離出的乳桿菌進行生理生化實驗和糖發酵試驗,結果見表1。根據實驗結果,參照《乳酸鑒定手冊》[4]和Bergey′s Manual of Systematic Bacterioology[6],菌株IMAU70081,IMAU70082生理生化試驗結果一致,革蘭氏陽性,接觸酶陰性,發酵葡萄糖產氣,屬異型乳酸發酵類型,p H值為4.5生長,15℃生長,45℃生長微弱。發酵核糖、葡萄糖、麥芽糖、蜜二糖等,弱發酵葡萄糖酸鈉,與短乳桿菌發酵特性相似,故判定IMAU70081,IMAU70082為短乳桿菌。

IMAU70080革蘭氏陽性,接觸酶陰性,能發酵葡萄糖但不產生氣體,屬同型乳酸發酵類型。在15℃生長,45℃生長良好,p H值4.5生長。發酵核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、蕈糖、乳糖、蜜二糖、棉籽糖、甘露醇、山梨醇,七葉苷、水楊苷、扁桃苷和葡萄糖酸鹽產酸,與植物乳桿菌發酵特性一致,故判定為植物乳桿菌。

IMAU70083,IMAU70084,IMAU70085均為革蘭氏陽性,接觸酶陰性,不發酵葡萄糖產氣,屬同型乳酸發酵類型。在15、45℃均生長良好,發酵核糖,葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖,蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、蕈糖、松三糖、甘露醇、山梨醇、七葉苷、水楊苷、扁桃苷和葡萄糖酸鈉,不發酵阿拉伯糖、木糖、鼠李糖。這些菌經鑒定為干酪乳桿菌。

表1 酸粥發酵液樣品中乳酸菌鑒定結果Tab.1 The identification result of lactic acid bacteria of the naturally fermented conjee starter culture

2.2.2 16S rRNA序列分析結果 采集自鄂爾多斯市不同地區的6份酸粥發酵劑樣品,在3個溫度下分離培養共得到18株乳桿菌。對這些分離株進行16S rRNA序列分析。通過BLAST序列比對分析和系統進化樹分析可知:8株菌與L.caseiATCC334的同源性在99%以上,從而將這8株菌歸屬為L.casei;有2株菌的16S rDNA/rRNA序列與菌株L.plantarumWCFS1的同源性是100%,認為這兩株菌為L.plantarum;有3株菌與菌株L actobacillus.brevisATCC367的同源性達99%以上,故判定此3株菌株為L.brevis;另有1株菌與L actobacillus f ermentumIFO3956的同源性達100%,認為這株菌為L.f ermentum;與L.helveticusDPC4571的同源性都在99%以上的4株菌定為L.helveticus。

采用MEGA4.0軟件分析伊盟地區的乳桿菌和5株模式菌株的16S rDNA/rRNA序列,繪制系統進化樹見圖1。從系統進化樹可得:總體上乳桿菌分為5個大群,第一群由9株菌構成,模式菌株為L.caseiATCC334,剩余8株菌與L.caseiATCC334的同源性都在99%以上;第二群由L.plantarumWCFS1,由2株中溫性菌構成;第三群以L actobacillus.brevisATCC367為參比,包括3株中溫菌;第四群由L.f ermentumIFO3956和一株高溫菌構成;第五群包括模式菌株L.helveticusDPC4571和4株高溫性乳桿菌。

其中對30℃分離菌株的同源性比對結果與傳統生化鑒定結果一致。

3 討 論

圖1 系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria

從采集自內蒙古伊盟地區的6份酸粥發酵液樣品中分離出18株乳酸菌,其中15℃培養分離出7株,30℃分離出6株,45℃分離5株,全部為桿菌。鑒定結果為:干酪乳桿菌(占總分離菌株的44.4%),植物乳桿菌(占總分離菌株的11.1%),短乳桿菌(占總分離菌株的16.7%),發酵乳桿菌(占總分離菌株的5.6%),瑞士乳桿菌(占總分離菌株的22.2%)。其中優勢菌為干酪乳桿菌,此結果與王鳳玲[11]等的研究結果一致,他們研究結果同時也表明,德氏乳桿菌也為優勢菌,Annamaria Ricciardi[12]等也有類似研究結果。其中15℃和30℃(中溫)分離株中干酪乳桿菌占61.5%,短乳桿菌占23.1%,而45℃(高溫)分離株中瑞士乳桿菌占80%,可見中溫性乳酸菌以干酪乳桿菌為優勢菌,其次為短乳桿菌;高溫性菌株則以瑞士乳桿菌為優勢菌。

李琦[13]等認為,植物乳桿菌為發酵糯玉米粘豆包中的優勢乳桿菌。Ebenezer Siaw Mante[14], Wisdom Kofi A Amoa-Awua[15],M Kostinek,I Specht[16],Akinrele I[17]認為,植物乳桿菌為發酵木薯中的優勢乳桿菌。植物乳桿菌和發酵乳桿菌被認為是巴西酸木薯淀粉[18]和尼日利亞發酵食品gari[19]中的優勢菌。短乳桿菌被認為是烏干達傳統發酵飲料bushera中的優勢菌[20]。而短乳桿菌和發酵乳桿菌被認為是尼日利亞發酵食品fufu和ogi的優勢菌[21],類似的報道也出現在Halm等[22]的研究中。植物乳桿菌和短乳桿菌也在其他的蔬菜發酵制品中有較多發現。可見,不同國家和地區以及不同的發酵谷物中乳酸菌的種類及構成也有較大差異,這可能與當地的環境、氣候、制作方法、發酵溫度等因素有關。不同國家和地區發酵谷物中乳酸菌的生物多樣性,為研究和開發乳酸菌資源奠定了良好的基礎。

本研究中干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌分別為中溫性乳酸菌和高溫性乳酸菌中的優勢菌,與其生長特性相符[23]。

作者還對30℃的分離株采用了傳統鑒定方法進行鑒定,其結果與16S rRNA分析方法所得鑒定結果完全相符。表明這些表型特征、生理生化特性仍是現代乳桿菌分類的重要指標,按照它們的生化特征來劃分仍是可取的,此研究結果也與A Corsetti[24]等一致。

4 結 語

作者以內蒙古伊盟地區采集的6份酸粥發酵液作為乳酸菌分離源,采用15、30、45℃3個不同溫度對乳酸菌進行了分離,采用16S rRNA序列分析的方法對所有菌株進行了種屬鑒定,并且還對30℃分離株采用傳統形態學特征和生理生化特性分析方法對其種屬特性進行了進一步的分析。作者共分離出18株乳酸菌,其中15℃分離出7株,30℃分離出6株,45℃分離出5株,全部為乳桿菌屬,干酪乳桿菌(L.casei)8株,植物乳桿菌(L.plantarum)2株,短乳桿菌(L.brevis)3株,發酵乳桿菌(L.f ermentum)1株,瑞士乳桿菌(L.helveticus)4株。傳統方法對30℃分離株的鑒定結果與其一致。

中溫性乳酸菌以干酪乳桿菌為優勢菌,其次為短乳桿菌;高溫性菌株則以瑞士乳桿菌為優勢菌。

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(責任編輯:李春麗)

Isolation and Identification of LAB from Naturally Fermented Congee in Ordos Area of Inner Mongolia

WANG Wei-hong, DU Xiao-hua, ZHANGJia-chao, YU Jie, LIU Wen-jun, SUN Tian-song, ZHAN G He-ping＊
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

Lactic acid bacteria were isolated and identified from 6 samples of fermentation broth for producing naturally fermented congee collected from different regions of Ordos area in Inner Mongolia,and then the biological characteristics of these isolates were investigated.A total of 18 lactic acid bacteria were isolated by incubating in MRS culture medium at 15,30,45℃.Based on 16S rRNAsequence analysis,all these isolates were identified as fivespecies includingL actobacillus(L.)casei(8 strains),L.plantarum(2 strains),L.brevis(3strains),L. f ermentum(1 strains)andL.helveticus(4 strains).Results showed thatL.caseiwas the predominant bateria in the culture of acid-gruel.The strains isolated from incubation at 30℃were also identified by physiological and biochemical test and the result of identification was consistent to the result of molecular method.

lactic acid bacteria,isolation,identification,16S rRNA sequence analysis

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)02-0265-06

2009-06-15

國家自然科學基金項目(30660135;30760156);教育部新世紀優秀人才支持計劃(NCET-06-0269);現代農業產業技術體系建設專項資金項目。

＊通信作者:張和平(1965-),男,內蒙古四子王旗人,工學博士,教授,博士生導師,主要從事乳品科學方面的研究。Email:hepingdd@vip.sina.com