COX-2和BCRP在非霍奇金淋巴瘤中表達的意義

趙永峰 蘇麗萍 鄭美婧 段靜靜

非霍奇金淋巴瘤治療的主要方法是化療。化療方法的選擇于淋巴瘤的組織病理學及與之相關聯的化療前預后風險的評估。盡管近30年來，非霍奇金淋巴瘤患者的生存率提高了30%以上且大多數的患者都達到了原發緩解，但目前的治療方法仍無法讓人滿意。非霍奇金淋巴瘤治療失敗的原因是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。

MDR是指由一種藥物誘發，但同時又對其他多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產生交叉耐藥［1］。乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是近年發現的一種耐藥相關蛋白，與P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白(MRP)同屬ABC轉運蛋白超家族，其過表達使腫瘤細胞對蒽環類藥物、羥基喜樹堿等產生抵抗［2］。Patel等［3］的研究表明:COX-2 可以上調 P 糖蛋白的表達。在對卵巢癌及乳腺癌的研究中發現COX-2與P糖蛋白的表達明顯相關［4，5］。臨床及實驗數據表明COX-2抑制劑的使用有助于提高癌細胞對化療藥物的敏感性［6-9］。目前，在非霍奇金淋巴瘤關于COX-2和BCRP在多藥耐藥方面的研究報道較少，本實驗通過對61例非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白及、BCRP基因表達及治療反應報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本院2008年9月至2009年7月收治的61例NHL患者，男35例，女26例，年齡18～81歲，中位年齡54歲。所有患者均經過病理切片形態觀察、免疫組化確診，病理分型按2001年WHO腫瘤分類，其中含56例B細胞淋巴瘤，5例T細胞淋巴瘤。依據Ann Arbor系統對疾病的臨床進展分類，I/II期36例，III/IV期25例。所有患者均接受6-8個療程的R-CHOP方案化療，其中31例化療敏感，30例化療耐受。在對數據分析時，依據IPI評分標準分為4組:低危組、中低危、中高危組以及高危組。10例反應增生性淋巴結炎作為陰性對照組。

1.2 設備及儀器 主要檢測儀器:Perkin Elmer公司lamddaBio10型紫外分光光度計，PE2400型。PCR擴增儀，Gene公司GDS-8000PCA凝膠成像分析系統。試劑:鼠抗人COX-2抗體及DAB顯色試劑盒均購于北京中山公司，SP免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。Trizol為Gibco產品，逆轉錄試劑盒購于Promega公司。BCRP上游引物:5’-AGATCAGCTACACCACCTCC-3’，下 游 引 物:5’-ACCCCGAACACCTTCTTA-3’，產物長度791bp;β-actin上游引物5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’: 下 游 引 物:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，產物長度1359bp。

1.3 免疫組化 所有標本經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續4 μm厚度切片。SP法染色步驟嚴格按照SP試劑盒說明進行。已知COX-2陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。結果判定:COX-2主要于淋巴瘤瘤細胞的胞漿內，計數高倍視野下1000個以上腫瘤細胞中陽性腫瘤細胞所占的百分比，以陽性細胞計數＞10%判定為COX-2表達陽性。

1.4 RT-PCR 手術獲得淋巴結標本后立即放入液氮或-70℃低溫冰柜中保存。所有標本均經臨床病理證實TRIZOL提取法提取細胞總RNA紫外線分光光度計定量RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為CDNA。BCRP基因PCR條件:用β-actin作內參照，按RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明書操作。反應總體積為25μL，反應條件為94℃預變性2 min;94℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，共 35 個循環;最后一循環于72℃5 min。取15μL產物用MCF一7/ADR做陽性對照進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將結果掃描、照象。同時，實驗設陽性對照組:乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR中BCRPmRNA的表達作為陽性對照。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件處理實驗數據，采用χ2檢驗對數據進行分析，以P＜0.05為統計學有意義。

2 結果

2.1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在非霍奇金淋巴瘤中的表達 COX-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的陽性表達率為50.8%，BCRP基因在非霍奇金淋巴瘤中的陽性表達率為45.8%，COX-2蛋白與BCRP基因在NHL的表達與對照組相比，差異有顯著性，(P＜0.05)。

2.2 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中表達的相關性在31例COX-2蛋白表達陽性的NHL患者中，BCRP mRNA陽性表達20例，而30例在COX-2陰性表達的NHL患者中，BCRP mRNA陽性表達僅8例。經檢驗COX-2蛋白和BCRP mRNA 表達呈正相關，χ2=8.795，r=0.355，P＜0.05。

2.3 COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達與臨床特征的關系COX-2和BCRP在NHL中的表達與臨床特征如年齡、性別、IPI、LDH、β2-微球蛋白等無明顯相關性(P＞0.05)，而與Ann Arbor分期 III/IV明顯相關(P＜0.05)，見表1。

表1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中的表達與臨床特征的關系

3 討論

我們研究了非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達，并對這些因子的表達與臨床病理參數之間的潛在的相關性進行了分析。在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發現有COX-2的表達;在45.8%的病例中發現有BCRP的表達。

環氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶。人體環氧化酶主要有兩種異構體:COX-1和COX-2。COX-1為結構型酶，在機體中穩定表達，維持機體正常生理功能。COX-2是花生四烯酸代謝過程中的一個關鍵酶，在正常組織中表達陰性或弱陽性，但在細胞受到各種致癌物刺激后表達上調。COX-2的過度表達促進了多種腫瘤的發生和發展(結腸癌，食道癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮膚癌，前列腺癌［10-17］，COX-2具有抗凋亡和促進腫瘤血管生成的作用。最近研究發現COX-2還可能具有調控腫瘤多藥耐藥的作用，是惡性腫瘤重要的預后不良因素之一。本實驗中，在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發現有COX-2的表達，提示其在非霍奇金淋巴瘤發病機制中發揮作用，這與其他的一些惡性腫瘤相似。在這項研究中，腫瘤細胞COX-2的過度表達與非霍奇金淋巴瘤患者的臨床和/或病理學數據之間沒有發現相關性。

乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是與藥物泵出有關的ABC膜轉運蛋白超家族中又一新的成員，首先由于Doyle等［18］1998年從有耐藥現象，但無P蛋白以及MRP1表達的乳腺癌細胞MCF-7/ADR發現的一種新的藥物轉運蛋白，該蛋白可將多種化合物從細胞內排出。Yoh等［19］采用免疫組化方法檢測72例確診為ⅢB和Ⅳ期非小細胞性肺癌的老年人的腫瘤標本中BCRP蛋白的表達，陽性率為46%。與順鉑為主的聯合化療療效的相關性分析提示，BCRP陰性者與BCRP陽性者有效率不同，兩者間差異無統計學意義(P=0.08)。在本實驗中，我們的研究已經證明了BCRP在非霍奇金淋巴瘤的表達與臨床效應之間存在正相關。同時，我們觀察到BCRP與COX-2在非霍奇金淋巴瘤表達明顯相關，提示 COX-2在BCRP介導的非霍奇金淋巴瘤多藥耐藥中可能發揮重要作用。

總之，COX-2與ABC轉運體蛋白BCRP之間的正相關，對于開展將COX-2抑制劑運用于提高非霍奇金淋巴瘤的化療敏感性的遠期臨床調查打下基礎。應用相對價廉的COX-2抑制劑可能在很大程度上提高非霍奇金淋巴瘤細胞對化療的敏感性。既然BCRP的表達與臨床反應相關，那么ABC轉運體似乎參與了非霍奇金淋巴瘤細胞的初始耐藥。BCRP作為非霍奇金淋巴瘤患者化療反應和復發危險性的預測因子，在臨床上有潛在的應用價值。

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