高效液相色譜法同時檢測食品中脫氫乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉的含量

梁 可，黃惠敏

洛陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南洛陽 471003

脫氫乙酸是一種在酸性、堿性條件下均有效的廣譜型防腐劑。其鈉鹽易溶于水，添加到食品當(dāng)中在不影響食品口味的情況下，能夠起到防腐、防霉、殺菌保鮮的作用，又因其在人體新陳代謝過程中逐漸分解為乙酸，對人體無毒，更是得到了食品加工行業(yè)的青睞。但目前，脫氫乙酸的安全性受到質(zhì)疑，我國臺灣省、日本、美國都在各類食品中規(guī)定了最大允許使用量，我國在一定范圍內(nèi)允許其使用，但最大允許使用量限定為300ug/mL。

我國檢測食品中脫氫乙酸的傳統(tǒng)方法為氣相色譜法，近年來高效液相色譜法也已經(jīng)被廣泛研究，但均只能對該單一物質(zhì)進(jìn)行檢測，并使用二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。而各級食品監(jiān)管部門在對食品質(zhì)量的監(jiān)督抽查中，還會涉及到對諸如傳統(tǒng)防腐劑山梨酸、苯甲酸，甜味劑糖精鈉等食品添加劑的檢測。如果沿用國家標(biāo)準(zhǔn)逐一分開檢測，不但增加了工作成本，而且降低了工作效率。本方法探討了用高效液相色譜法紫外檢測器同時對脫氫乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉進(jìn)行檢測，更快速，更高效。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑

液相色譜儀：Waters 1525 型，配有紫外檢測器；離心機(jī)：10 000r/min，TGL-16A高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；甲醇：色譜純，TEDIA COMPANY；乙酸銨：優(yōu)級純，廣州化學(xué)試劑廠；碳酸氫鈉：優(yōu)級純，科密歐試劑；紫外可見分光光度計：TU-1810，北京譜析通用儀表有限責(zé)任公司。

1.0mg/mL 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.100g，加碳酸氫鈉（20g/l）5mL，微熱溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作為儲備溶液4℃保存。

1.0mg/mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.100g，加碳酸氫鈉（20g/L）5mL，加熱溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作為儲備溶液。

1.0mg/mL 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.100g，加碳酸氫鈉（20g/L）5mL，加熱溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作為儲備溶液。

1.0mg/mL 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.0851g 經(jīng)120℃烘干4h 后的糖精鈉，加水定容至100mL，作為儲備溶液。

脫氫乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)混合使用液：取脫氫乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各10.0mL，放入100mL 容量瓶中，加水至刻度。此溶液含脫氫乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉各0.1mg/mL。可根據(jù)需要稀釋成不同濃度，經(jīng)0.45um 濾膜過濾。

1.2 樣品處理

稱取均勻化的試樣2.5g，加水定容至25.0mL。超聲提取10min，轉(zhuǎn)入離心管中，5 000r/min 離心10min。取上層清液0.45um 濾膜過濾。蛋白質(zhì)含量高的樣品在定容前需加人少量亞鐵氰化鉀及乙酸鋅以沉淀蛋白質(zhì)，以下操作同上

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(2) 5um 4.6×250mm；

流動相：甲醇-乙酸銨溶液（0.02mol/L）（5:95）；

流速：1.0mL/min；

進(jìn)樣量：10uL；

檢測器：紫外檢測器，230nm 波長。

按上述色譜條件，采用外標(biāo)法，以保留時間定性，峰面積定量，測得樣液中脫氫乙酸濃度（mg/L）。

1.4 結(jié)果計算

樣品中脫氫乙酸含量（g/kg）=C×V×10-3/m

式中，C 為樣品中脫氫乙酸濃度（mg/L），V 為樣液體積（mL），m 為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取

防腐劑、甜味劑都是以易溶于水的鹽的形式添加到食品當(dāng)中的，所以本方法采用直接用水溶解樣品并加以提取，既保證了高回收率，又能減少使用有機(jī)物方法提取的污染，還節(jié)約了成本。

2.2 檢測波長的選擇

利用紫外分光光度計對脫氫乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，見圖1，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長在290nm和230nm 處。因為山梨酸、苯甲酸、糖精鈉在230nm 處也有明顯的吸收，為便于同時檢測，我們選擇230nm 作為檢測波長。

圖1

2.3 流動相的選擇

在反相C18 柱中最常見的流動相為甲醇-乙酸銨溶液（0.02mol/L）系統(tǒng)。兩者比例的大小，直接影響到出峰時間和峰形對稱性。本方法經(jīng)過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)：當(dāng)甲醇-乙酸銨溶液（0.02mol/l）體積比為5:95時，4種待測物質(zhì)有較好的分離度。而且整體出峰時間靠后，有效的避開了雜質(zhì)峰的干擾。

2.4 色譜分離及線性實驗

在1.3 色譜條件下測定，山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、脫氫乙酸（鈉）的保留時間分別為10.04min、13.64 min、18.13 min、19.92 min。峰形及組分分離效果均較好。以各組分的濃度與對應(yīng)色譜峰面積有良好的線形關(guān)系，線形相關(guān)系數(shù)山梨酸為0.9993、苯甲酸為0.9995、 糖精鈉為0.9995、脫氫乙酸為0.9966。

2.5 重現(xiàn)性及回收率

序號加標(biāo)量/（ug/ml）檢測結(jié)果/（ug/ml）平均值/（ug/ml） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 回收率/%1 0 15.233 2 0 15.893 3 0 16.021 4 10.0 15.716 0.42 /25.346 5 25.814 0.41 101.0%35.223 25.994 6 26.102 7 20.0 8 35.153 0.06 97.2%45.867 35.120 9 35.116 10 30.0 11 46.101 12 46.231 46.066 0.18 101.2%

分別稱取同一樣品（n=3），按本方法加標(biāo)測定，結(jié)果見表，加標(biāo)回收率為97.2%～101.2%，平均回收率為99.8%。見表1。

2.6 檢出限

檢出限為最低相應(yīng)值（3 倍儀器噪音水平）與絕對相應(yīng)值的比值。經(jīng)實驗證明，該法檢測脫氫乙酸的色譜法檢出限為0.25ug/ml，比用293nm 波長檢測脫氫乙酸色譜法檢出限低2 倍左右。山梨酸、苯甲酸、糖精鈉因沿用GB/T5009.29-2003的方法條件，這里不再累述。

3 結(jié)論

食品添加劑的檢測，一直以來都是各個檢測機(jī)構(gòu)重要的檢測項目。近年來，利用高效液相色譜法檢測脫氫乙酸的研究也逐步趨向成熟化，同時檢測脫氫乙酸、苯甲酸、山梨酸等食品添加劑的方法也有研究和報道，但多是采用二極管陣列檢測器（DAD）進(jìn)行檢測，由于檢測設(shè)備昂貴，許多中、低水平的檢驗機(jī)構(gòu)都無法普及。本方法采用紫外檢測器，對上述的4種添加劑同時作出檢測，大大降低了檢驗成本，并且通過改變檢測波長提高了脫氫乙酸的檢出靈敏度，方法更加簡便、快捷。但筆者也反復(fù)試驗，希望通過調(diào)整流動相PH 以改善脫氫乙酸峰拖尾的問題。但因條件有限為能達(dá)成。希望有條件的單位能夠完成。

[1]王竹天.食品衛(wèi)生檢驗方法（理化部分）注解（上、下）.中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.

[2]GB/T23377-2009 食品中脫氫乙酸的測定高效液相色譜法.