組織工程化軟骨分泌蛋白的初步蛋白質組學分析

劉霞 周廣東 劉偉 曹誼林

組織工程化軟骨分泌蛋白的初步蛋白質組學分析

劉霞 周廣東 劉偉 曹誼林

目的通過蛋白質組學篩選組織工程化軟骨分泌的可溶性蛋白中具有軟骨誘導作用的因子。方法分別培養人軟骨細胞與皮膚成纖維細胞，接種到PGA上，兩種細胞-材料復合物培養2周后，移至無血清培養基中培養6 d，并收集所有培養液，用于差異蛋白質組學分析。結果蛋白組學分析顯示有21個差異點。對其中差異最大的點作質譜分析，顯示該蛋白與Col2A1異構體2最為匹配。結論用蛋白質組學方法，可以高通量篩選軟骨細胞分泌的，與軟骨分化相關的重要蛋白；Col2A1異構體2可能與軟骨分化有關。

組織工程化軟骨蛋白質組學誘導因子

我們的前期研究已證實，軟骨細胞提供的組織微環境能夠誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）向軟骨分化[1－2]，特別是軟骨細胞分泌的可溶性因子發揮了重要的誘導作用[3]。但是，尚不清楚究竟是哪些可溶性因子在發揮作用。

可溶性因子成分種類繁多，需要采用大容量、多因素的方法進行分析，蛋白質組學是比較合適的研究手段[4]。因此，我們收集軟骨細胞-材料復合物和成纖維細胞-材料復合物的培養液，期望通過蛋白質組學分析，比較兩者分泌蛋白的差異，初步篩選可能具有誘導作用的因子。

1 材料與方法

1.1 取材來源

流產胎兒，4～6月齡，性別不限，由411醫院提供，獲家屬知情同意。

1.2 三維支架材料制備

[5]的方法，將聚羥基乙酸（PGA）均勻地嵌入圓柱狀硅膠模具內定型，消毒后置于六孔板內備用。

1.3 胎兒關節軟骨細胞的分離、培養、擴增及接種

于無菌條件下切取胎兒部分關節軟骨，切成約2mm×2mm×1mm大小的軟骨塊。加入0.1%膠原酶NB4，37℃下消化2 h，棄上清，換0.05%膠原酶NB4消化過夜，過濾、離心、洗滌，以含10%FBS的低糖DMEM培養液制成細胞懸液。以3×104cells/cm2密度接種于培養皿內，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養，每3天換液1次。細胞生長達到90%融合時，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化、傳代。將第一代細胞接種到PGA支架材料，每個培養孔內加入5 mL常規培養液，于37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養。

1.4 胎兒皮膚成纖維細胞的分離、培養、擴增及接種

取胎兒背部皮膚組織，去除皮下脂肪后加入0.1%中性蛋白酶，4℃下消化過夜，揭去表皮層。真皮組織以0.1%膠原酶NB4于37℃下消化8 h，過濾、離心、洗滌，加入含10%FBS的低糖DMEM培養液制成細胞懸液，以2×104cells/cm2的密度接種于培養皿，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養，每3天換液1次，細胞生長達85%融合后傳代。將第二代細胞接種到PGA支架，每個培養孔內加入5 mL常規培養液，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養。

1.5 蛋白質組學分析

1.5.1 培養液收集

細胞-材料復合物培養2周后，用PBS沖洗3次，換成無血清培養液培養，48 h收集一次培養液，收集3次。收集的培養液以2 000 r/min離心8min，取上清置于-80℃冰箱備用。由中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心完成蛋白質組學研究。

1.5.2 樣品的蛋白濃縮

樣品經超濾、除鹽和濃縮后，進行蛋白定量。雙向電泳采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），上樣量50μg，IEF為pH值3～10非線性膠條（電泳條件：30 V、10 h，500 V、1 h，1 000V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h），電泳至溴酚藍距離膠下沿0.5 cm，然后銀染、掃描，獲得圖譜。對樣品之間量變情況進行分析，采用Image Master軟件分析報告（C lass report ratio≥1.5），所有差異點比較均為P＜0.05。

1.5.3 質譜分析

取分泌差異最大的蛋白點作質譜分析。膠內胰酶酶解20 h，抽提酶解肽段。Zip Tip脫鹽后，液相色譜-電噴霧離子化質譜（ESI-MS）檢測。全掃描后采集10個碎片圖譜（MS2 scan），用Bioworkers軟件搜索IPIhuman蛋白庫，得到鑒定的蛋白質結果。過濾參數為：當Charge+1，Xcorr≥1.9；當Charge+2，Xcorr≥2.2；當Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。

2 實驗結果

2.1 胎兒軟骨細胞與成纖維細胞的生長情況

原代軟骨細胞12～24 h貼壁，貼壁時呈圓形，伸展后呈多角形，以類似同源細胞群的生長方式形成獨立小群體，5 d左右可達90%匯合，傳代后成多角形，細胞增大。

原代成纖維細胞約48 h貼壁，貼壁時呈小三角形或長梭形，約7 d達到85%以上匯合，傳代后增殖速度加快，呈長梭形或細長紡錘形，細胞排列有一定方向性（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態（40×）

2.2 二維電泳

取50μg蛋白上樣，得到比較理想的二維電泳圖譜，背景較好，蛋白點的遷移也基本穩定。取軟骨細胞-材料復合物的培養液濃縮蛋白，重復3次二維電泳實驗，分別分離出1 670、2 194和2 076點；同法處理成纖維細胞-材料復合物的培養液濃縮蛋白，分別分離出1 984、2 296和1 847點（圖2）。以軟骨細胞-材料復合物分泌蛋白的電泳膠作為參考膠，與成纖維細胞-材料復合物分泌蛋白的電泳膠比較，找到21個差異點。

圖2 二維電泳結果顯示兩者比較有21個差異點

2.3 質譜分析

取軟骨細胞較成纖維細胞分泌差異最大的蛋白點進行質譜分析，顯示該蛋白與Col2A1異構體2最為匹配。

3 討論

既往研究證實，軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子作為一個整體誘導因素，能夠單獨誘導BMSCs向軟骨分化、并形成軟骨組織[3]。我們認為，這些可溶性因子是軟骨微環境發揮軟骨誘導作用的重要因素之一。軟骨細胞能夠分泌TGF-β、IGF等多種生長因子，在軟骨細胞的增殖與分化中發揮重要作用[6－7]。但是，尚不清楚這些因子或其他因子，在誘導BMSCs向軟骨分化中是否也發揮重要作用。

蛋白質組學是對基因組編碼的所有蛋白質，即蛋白質組進行大規模研究的一門科學[5]。蛋白質組學技術具有大規模、高通量等優點，可用于研究復雜的多種細胞因子和蛋白質的變化，因而已逐漸成為干細胞和組織工程領域新的研究熱點[8－9]。前期研究中，我們發現軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子能夠誘導BMSCs向軟骨分化，而成纖維細胞-材料復合物分泌的可溶性因子卻沒有成軟骨誘導作用。因此，我們希望通過對這兩種細胞-材料復合物所分泌可溶性蛋白的差異蛋白質組學研究，篩選軟骨細胞分泌的、具有軟骨誘導作用的可溶性因子。

軟骨細胞高表達的蛋白對軟骨分化有正向誘導作用的可能性較大，因此以軟骨細胞分泌蛋白的2-D膠作為參考膠，與成纖維細胞分泌蛋白比較，共找到21個差異點。我們取軟骨細胞較成纖維細胞高表達，且分泌水平差異最大的蛋白進行質譜分析，發現其與Col2A1異構體2的同源性最高。

Ⅱ型膠原為軟骨細胞特異性分泌的蛋白。Ⅱ型前膠原根據不同的剪接方式有兩種表達形式，Col2A和Col2B。其中Col2A僅在軟骨前體細胞和軟骨聚集和生長區域表達，而已分化的軟骨細胞僅分泌Col2B[10-11]。Col2A前膠原的氨基端能夠與BMP-2、TGF-β相結合，誘導體內、外軟骨形成[12-13]。關于Col2A1異構體2在軟骨細胞中的表達情況及其在軟骨分化中的作用，迄今尚無報道。我們發現，Col2A1異構體2在軟骨細胞-材料復合物分泌的蛋白中特異性高表達，推測它可能在軟骨分化中也具有一定的誘導作用。

在后續研究中，我們將對其他差異蛋白進行分析，并在此基礎上通過誘導實驗和中和抗體阻斷實驗，進一步篩選出能誘導BMSCs向軟骨分化的因子。此外，Col2A1異構體2在軟骨分化中的作用，也是我們今后的研究重點之一。

參考文獻

[1]周廣東,苗春雷,曹誼林,等.軟骨細胞與骨髓基質細胞共培養體外軟骨形成的實驗研究[J].中華醫學雜志,2004,84(20):1716-1720.

[2]劉霞,周廣東,曹誼林,等.軟骨細胞與骨髓基質干細胞共培養軟骨構建的體內評價[J].中華醫學雜志,2007,87(27):1929-1933.

[3]劉霞,周廣東,曹誼林,等.組織工程化軟骨分泌的可溶性因子對骨髓基質干細胞誘導作用的實驗研究[J].中華整形外科雜志, 2010,26(3):215-220.

[4]James P.Protein identification in the post-genome era:the rapid rise of proteomics[J].Q Rev Biophys,1997,30(4):279-331.

[5]劉霞,周廣東,曹誼林,等.人真皮成纖維細胞體外構建組織工程化軟骨的初步探索[J].中華整形外科雜志,2009,25(6):447-450.

[6]Grimaud E,Heymann D,Redini F.Recent advances in TGF-beta effects on chondrocyte metabolism.Potential therapeutic roles of TGF-beta in cartilage disorders[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2002,13(3):241-257.

[7]Trippel SB.Growth factor actions on articular cartilage[J].J Rheumatol Suppl,1995,43:129-132.

[8]PrudhommeW,Daley GQ,Zandstra P,et al.Multivariate proteomic analysis of murine embryonic stem cell self-renewal versus differentiation signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9): 2900-2905.

[9]Wang D,Park JS,Chu JS,etal.Proteomic profiling ofbonemarrow mesenchymal stem cells upon transforming growth factor beta1 stimulation[J].JBiol Chem,2004,279(42):43725-43734.

[10]Zhu Y,Oganesian A,Keene DR,et al.Type IIA Procollagen containing the cysteine-rich amino propeptide is deposited in the extracellularmatrix of prechondrogenic tissue and binds to TGF-beta 1 and BMP-2[J].JCell Biol,1999,144(5):1069-1080.

[11]Sandell LJ,Morris N,Robbins JR,etal.Alternatively spliced typeⅡprocollagen mRNAs define distinct populations of cells during vertebraldevelopment:differential expression of theamino-propeptide [J].JCell Biol,1991,114(6):1307-1319.

[12]Denker AE,Nicoll SB,Tuan RS.Formation of cartilage-like spheroids bymicromass cultures ofmurine C3H10T1/2 cells upon treatmentwith transforming growth factor-beta1[J].Differentiation, 1995,59(1):25-34.

[13]Wang EA,Rosen V,D’Alessandro JS,et al.Recombinant human bonemorphogenetic protein induces bone formation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(6):2220-2224.

Prelim inary Proteom ic Analysis of Proteins Secreted by Tissue-engineered Cartilage

LIU Xia1,ZHOU Guangdong2, LIUWei2,CAO Yilin1,2.
1 Plastic Surgery Institute,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School ofMedicine,Shanghai200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong.

ObjectiveTo screen the chondrogenic factors in soluble proteins secreted by the engineered cartilage using proteomic approach.M ethodsHuman chondrocytes and dermal fibroblastswere collected,and then seeded onto the PGA scaffolds.At 2 weeks,the two types of cell-scaffold constructswere cultured in serum-freemedia for 6 days.All the serumfree media were collected for proteomic analysis.ResultsThe proteome maps showed 21 difference spots.On mass spectrometry(MS),the protein showing the most significant difference of expression matched best with alpha 1 typeⅡcollagen isoform 2.ConclusionProteomic approach is a high throughoutmethod to screen the important chondrogenic factors secreted by the tissue-engineered cartilage.Alpha 1 typeⅡcollagen isoform 2 may be related to chondrogenic differentiation.

Tissue engineered cartilage;Proteomics;Inductive factors

book=145,ebook=17

Q816

A

1673－0364（2010）03－0145－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.006

2010年3月3日；

2010年4月10日)

國家重點基礎研究發展規劃項目（973項目）（2005CB522702）；國家高技術發展計劃項目（863項目）重大專項（2006AA02A126）；高等學校博士學科點專項科研基金（200800231078）；國家自然科學基金項目（30801192，30973131，30772264）；上海市曙光計劃（08SG19）；上海市啟明星跟蹤計劃（09QH1401600）。

100144北京市中國醫學科學院整形外科醫院（劉霞，曹誼林）；200011上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科（周廣東，劉偉，曹誼林）。

周廣東。