8味中藥提取物對MC3T3-E1細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響

馮淑華， 陳 虹， 劉 薇

(1.北京聯合大學生物化工學院，北京 100023;2.武警醫學院，天津 300162)

現代醫學研究證明，骨質疏松是一種多因素引起的骨代謝病。近年的研究報道，補腎中藥對骨代謝有綜合的、整體調節作用，具有防治骨質疏松的功效，且副作用小，具有良好的應用前景。本文選擇具有補腎功能的八種中藥進行初步研究，測試它們的不同提取物對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖和細胞內外堿性磷酸酶的影響［1］，為進一步研究其對骨形成的作用和為臨床有效利用這些藥物提供參依據。

1 材料與方法［1，2］

1.1 材料

成骨細胞MC3T3-E1購自中國協和醫科大學細胞中心;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氫溴酸鹽(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium Bromide，MTT)為Sigma公司產品。DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium，改良Eagles)培養基及胰蛋白酶為Gibeco公司產品。胎牛血清(FBS)購自北京鼎國生物技術責任有限公司。堿性磷酸酶試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;對硝基苯酚磷酸鈉(PNPP)為Sigma分裝。氨芐青霉素(Ampicilin sodium salt)、鏈霉素(Streptomysin)均為美國Amresco公司產品;

SW-LZ-ZFO型超凈工作臺(中國蘇州);Forma 3111型CO2培養箱(美國);Bio-Rad 550型酶標儀(美國);微量振蕩儀(中國姜堰市醫療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 取藥材粗粉適量，70%乙醇回流提取2次(2 h/次)，減壓回收乙醇得浸膏。分別依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行萃取，減壓回收溶劑，分別得到不同的提取部位，各部分的收率和代號見表1。將各部分溶于適量DMSO，配置成初濃度為250 mg/mL的溶液，超聲溶解，待藥物完全溶解后保存待用。

1.2.2 細胞培養 將成骨細胞MC3T3-E1接種于含15%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的 MEM 培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

表1 8種中藥的提取結果

1.2.3 藥物對MC3T3-E1細胞增殖的影響 取對數生長期生長狀態良好的MC3T3-E1細胞，消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養基配成活細胞濃度為2×104個/mL，接種于96孔培養板中，0.1 mL/孔，培養24 h，細胞完全貼壁后，分為對照組只加等體積的溶劑;實驗組加入濃度分別為250、25、2.5 μg/mL 的藥物;陽性藥物組加入濃度為 10-7mol/L的雌酚酮;另設一空白組不加細胞只加培養基;每組設8個復孔。

繼續培養96 h后每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，37℃、5%CO2培養箱中孵育4 h后倒掉培養基，將板晾干，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，在搖板機上震蕩20 min，用酶標儀，于490 nm處測定各孔光密度值(OD)。

1.2.4 藥物對MC3T3-E1細胞內ALP活性的影響 調整細胞濃度為4×104個/mL，各取0.1 mL接種于96孔培養板，置37℃，5%CO2溫箱中培養。待24 h細胞完全貼壁后，按上述空白對照組、對照組、雌酚酮陽性對照組和藥物組的濃度加入相應的藥物。每個濃度設8個復孔。加藥72 h后，將細胞用PBS緩沖液沖洗3次，最后一次吸干PBS，每孔加入工作液150 μL(50 mmol/L 的 DEA 100 μL，2.5 mmol/L 的PNPP 50 μL)，37℃恒溫箱反應 30 min，取出。加入 0.1 mol/L NaOH 100 μL終止反應。每孔取150 μL加入96孔酶標板中，用酶標儀于405 nm處測量各孔光密度值(OD)。

1.2.5 藥物對MC3T3-E1細胞外ALP活性的測定 同上法將細胞進行鋪板和分組，加藥72 h后，取培養液20 μL于96孔酶標板，加底物反應液(PNPP-DEA溶液:MgCl2·6H2O 101.7 mg，12 mol/L HCl 1.95 mL，DEA 10 mL 加蒸餾水至50 mL，臨用前與3 mmol/L PNPP等量配制)，37℃水浴中反應10 min，加0.1 mol/L NaOH 90μL終止反應，于405 nm處測量各孔光密度。用(90 μL反應液 +90 μL終止液 +20 μL培養液)調零。

2 結果

2.1 8種中藥總提取物和不同溶劑萃取結果

每種藥材的用量均為100 g，提取結果見表1。

2.2 藥物對MC3T3-E1細胞增殖的影響

細胞經藥材提取物處理72 h后，結果與對照組比較，具有不同的增值作用。桑寄生(Ⅲ)的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃取殘余物、雞血藤(Ⅳ)的乙酸乙酯萃取物和萃余物、巴戟天(Ⅵ)萃余物、葫蘆巴(Ⅶ)的萃余物及射干(Ⅷ)的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物在不同濃度時對MC3T3-E1細胞具有增殖作用(P﹤0.05)，以上各部分對細胞增殖作用的強度均強于陽性對照雌酚酮，其中葫蘆巴萃余物、射干石油醚萃取物的作用強度高于雌酚酮的3～4倍，見表2。

2.3 藥物對MC3T3-E1細胞內外ALP活性的影響

經PNPP法檢測，雌酚酮對細胞內ALP活性與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);細胞內ALP活性增加與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)的有:桑寄生萃余物(Ⅲ-4)的中高濃度組、雞血藤乙酸乙酯萃取物(Ⅳ-3)和萃余物(Ⅳ-4)的低濃度組、巴戟天萃余物(Ⅵ-4)的中濃度組;與雌酚酮組相比，桑寄生(Ⅲ-3)、雞血藤(Ⅳ-3、Ⅳ-4)的乙酸乙酯萃取物和萃余物部分對細胞內ALP活性相當或高于雌酚酮，其它藥材對細胞內ALP活性的影響低于雌酚酮組見表2。

經PNPP法檢測，雌酚酮對細胞外ALP活性與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，細胞外ALP活性增加與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，其有桑寄生的萃取物(Ⅲ-4)高濃度組、雞血藤萃余物(Ⅳ-4)的高和中濃度組、巴戟天萃余物(Ⅵ-4)低濃度組、葫蘆巴氯仿萃取物(Ⅶ-2)的高中低濃度組。與雌酚酮組相比，桑寄生的萃取物(Ⅲ-4)、雞血藤乙酸乙酯萃取物(Ⅳ-3)和萃余物(Ⅳ-4)、葫蘆巴石油醚(Ⅶ-1)、氯仿(Ⅶ-2)和乙酸乙酯萃取物(Ⅶ-3)和射干的萃余物(Ⅷ-4)均相當于或高于雌酚酮組，見表2。

3 討論

MC3T3-E1細胞株是1981年日本學者Kadama等由新生C57BL/6小鼠顱頂骨中分離培養所建立的一株成骨細胞株，該細胞株具備體外培養成骨細胞的各種生物學特性，包括堿性磷酸酶活性、Ⅰ型膠原合成和基質礦化等，是一株良好的體外培養成骨細胞株，國際上常作為骨代謝研究的細胞模型［2］。其增殖在某種程度上可反映成骨細胞的增殖，而成骨細胞是骨代謝過程中的重要細胞，其增殖有利于骨形成。

堿性磷酸酶(ALP)是一種同源二聚體的糖蛋白，是成骨細胞分化成熟和功能的標志，是識別及評價成骨細胞分化程度的生化指標。ALP是成骨細胞分化的一個早期指標，其表達隨著細胞分化的發展而增強［3］，是骨形成所必須的酶，其活性反映了成骨細胞的活性，其活性高低也能代表成骨細胞功能強弱。ALP可分解有機磷酸釋放無機磷，增加局部無機磷酸的濃度，促進礦化，所以ALP活性升高可為細胞間質改變做好準備，并且是啟動礦化的必備條件。

本實驗通過對8味中藥對MC3T3-E1細胞的增殖作用及細胞內外ALP活性作用判斷藥物對骨形成、骨細胞分化成熟的影響，從而為藥物的進一步開發打下基礎。

實驗結果表明中藥桑寄生(Ⅲ)、雞血藤(Ⅳ)、巴戟天(Ⅵ)、葫蘆巴(Ⅶ)、射干(Ⅷ)不同萃取物對MC3T3-E1細胞增殖和細胞內外ALP活性有促進作用，提示這些中藥具有促進成骨細胞增殖和分化的作用。

表2 藥物對MC3T3-E1細胞增殖、細胞內外ALP活性的影響結果(±s，n=8)

表2 藥物對MC3T3-E1細胞增殖、細胞內外ALP活性的影響結果(±s，n=8)

注:與對照組相比，*P＜0.05，與對照組相比，**P＜0.01。

藥物 藥物濃度/(μg/mL)細胞增殖OD值 增殖率/%細胞內ALP OD值細胞外ALP OD 值對照00.376±0.012 0.104±0.031 0.183±0.001雌酚酮 1×10-7mol/L 0.418±0.016 11.17 0.236±0.029* 0.205±0.002*Ⅲ-2 2.5×10-2 0.490±0.049* 30.32# 0.112±0.009 0.188±0.011 2.5×10-1 0.442±0.036 17.55 0.239±0.023* 0.189±0.010 2.5 0.432±0.046 14.90 0.246±0.022* 0.210±0.010*Ⅲ-3 2.5×10-2 0.493±0.018* 31.11# 0.298±0.018** 0.210±0.020*2.5×10-1 0.489±0.021* 30.05# 0.284±0.016* 0.193±0.020 2.5 0.568±0.019* 51.06# 0.278±0.028* 0.198±0.003Ⅲ-4 2.5×10-2 0.469±0.041* 24.73 0.272±0.002* 0.243±0.021*2.5×10-1 0.487±0.013* 29.52 0.320±0.003** 0.241±0.018*2.5 0.499±0.001* 32.71# 0.320±0.004** 0.252±0.032**Ⅳ-3 2.5×10-2 0.490±0.028* 30.32 0.324±0.004** 0.203±0.021 2.5×10-1 0.515±0.032* 36.97# 0.255±0.032* 0.228±0.018*2.5 0.438±0.017 16.45 0.242±0.022* 0.218±0.022*Ⅳ-4 2.5×10-2 0.499±0.006* 32.71# 0.282±0.031* 0.245±0.003**2.5×10-1 0.487±0.002* 29.52 0.295±0.031** 0.243±0.002**2.5 0.452±0.001 20.21 0.287±0.030* 0.243±0.009**Ⅵ-4 2.5×10-2 0.431±0.009 14.63 0.207±0.005* 0.248±0.011**2.5×10-1 0.442±0.031 17.55 0.238±0.004* 0.236±0.011*2.5 0.463±0.022 23.12 0.231±0.002* 0.235±0.012*Ⅶ-1 2.5×10-2 0.463±0.056 23.13 0.237±0.002* 0.188±0.012 2.5×10-1 0.385±0.023 2.39 0.212±0.012* 0.233±0.001*2.5 0.380±0.009 1.06 0.203±0.002* 0.227±0.002*Ⅶ-2 2.5×10-2 0.383±0.016 1.78 0.223±0.010* 0.240±0.002**2.5×10-1 0.381±0.076 1.33 0.220±0.010* 0.241±0.001**2.5 0.406±0.008 7.98 0.218±0.010* 0.242±0.003**Ⅶ-3 2.5×10-2 0.388±0.056 3.11 0.162±0.034* 0.218±0.003 2.5×10-1 0.370±0.032 -1.67 0.153±0.030* 0.226±0.012*2.5 0.414±0.061 10.11 0.157±0.032* 0.228±0.005*Ⅶ-4 2.5×10-2 0.620±0.032* 64.89# 0.097±0.004 0.163±0.012 2.5×10-1 0.477±0.006* 26.86 0.160±0.020* 0.163±0.020 2.5 0.531±0.056* 41.22# 0.178±0.012* 0.168±0.020Ⅷ-1 2.5×10-2 0.560±0.007* 48.94# 0.194±0.010* 0.178±0.010 2.5×10-1 0.587±0.032* 56.12# 0.188±0.018* 0.155±0.010 2.5 0.652±0.012* 73.40# 0.172±0.016* 0.172±0.002Ⅷ-2 2.5×10-2 0.406±0.022 7.97 0.204±0.007* 0.215±0.011*2.5×10-1 0.395±0.022 4.97 0.224±0.014* 0.207±0.009*2.5 0.438±0.016 16.50 0.215±0.013* 0.214±0.005*Ⅷ-3 2.5×10-2 0.564±0.001* 50.00# 0.214±0.024* 0.180±0.008 2.5×10-1 0.440±0.002 17.02 0.149±0.028* 0.199±0.021 2.5 0.402±0.004 6.91 0.194±0.008* 0.201±0.002Ⅷ-4 2.5×10-2 0.435±0.023 15.69 0.192±0.014* 0.217±0.002*2.5×10-1 0.391±0.026 3.91 0.192±0.011* 0.217±0.004*2.5 0.431±0.008 14.62 0.185±0.09* 0.214±0.003*

本實驗結果初步證明:中藥桑寄生、雞血藤、巴戟天、葫蘆巴、射干的不同提取物使MC3T3-E1細胞內外的ALP的活性增強，強度與雌酚酮相當，推測可能具有雌激素樣促進成骨樣細胞合成和分泌ALP的作用，將上述藥材的提取物分離純化及對MC3T3-E1細胞的作用活性尚在進一步研究中。

［1］唐 琪，陳莉麗，嚴 杰.骨碎補提取物促小鼠成骨細胞株MC3T3-E1細胞增殖、分化和鈣化作用的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29(2):164-168.

［2］王洪復主編.骨細胞圖譜與骨細胞體外培養技術［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2001:63-64.

［3］Enmark E，Pelto-Huikko M，Grandien K，et al.Human estrogen receptor β-gene structure，chromosomal localization，and expression pattern［J］.J Clin Endocrinol Metab，1997，82:4258-4265.