黏質沙雷氏菌產幾丁質酶的發酵工藝優化

施騰鑫,劉嘉,賀淹才

(華僑大學化工學院,福建泉州362021)

黏質沙雷氏菌產幾丁質酶的發酵工藝優化

施騰鑫,劉嘉,賀淹才

(華僑大學化工學院,福建泉州362021)

利用均勻設計法,優化一株黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)產幾丁質酶培養基的組分;同時,利用正交設計法優化其搖瓶發酵產酶的條件.研究結果表明,最佳培養基組分(質量分數):0.504%膠體幾丁質, 1.178%酵母粉,0.025%M gSO4·7H2O,0.095%K2HPO4,0.001%FeSO4·7H2O,0.005%山梨醇,0.030% KH2PO4;最佳搖瓶發酵工藝條件:培養時間為48 h,發酵溫度為30℃,初始p H值為9.0,裝液量為30 mL,接種量為1%.在此優化條件下,酶活力可達9.39μkat·L-1,比未優化的產酶條件下酶活力提高了81.6%.

黏質沙雷氏菌;幾丁質酶;均勻設計;正交設計

幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖用途廣泛,除具有抗腫瘤等藥用價值外,其應用還涉及到工業、農業和環保等領域[1-2].化學方法生產幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,面臨反應產物難以控制,易造成環境污染等困難.因此,利用幾丁質酶(Chitinase,EC3.4.1.14)降解、生產幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,越來越引起人們的重視.幾丁質酶在實際中應用程度還比較低,主要原因之一是所選菌株產酶能力太低.目前,僅僅對一些產幾丁質酶的基因進行了克隆和序列分析,因此,優化微生物產幾丁質酶的外部條件,仍是提高微生物菌株產酶水平的主要方法之一[3-4].采用常規優化法(即單因素法)優化幾丁質酶發酵條件的研究已有大量報道,而利用統計學方法優化幾丁質酶生產的報道卻比較少見[5-6].本文通過常規優化法對黏質沙雷氏菌的產酶條件進行預試驗,結合均勻設計法和正交設計法,對該菌的產幾丁質酶培養基組分及發酵工藝條件進行優化.

1 材料與方法

1.1 菌株

黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens,A TCC14041),購于中科院微生物研究所,在Eppendo rff管中添加質量分數為20%的甘油,并于-70℃下保存.

1.2 試劑與儀器

(1)試劑.幾丁質粉(美國Sigma公司);蛋白胨、酵母粉(英國Oxoid公司);其他試劑為國產分析純.(2)儀器.M icromax(RF)小型臺式(冷凍)離心機(北京博奧恒信生物科技有限公司);HYG-Ⅱ恒溫調速搖瓶柜(上海欣蕊自動化設備有限公司);SP-2000型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司).

1.3 培養基

基礎培養基(1 L):含0.5 g膠體幾丁質,1.0 g蛋白胨,0.5 g M gSO4·7H2O,0.07 g K2HPO4, 0.03 g KH2PO4,0.001 g FeSO4·7H2O,p H=7.0～7.2.膠體幾丁質的制法參考文[7].

1.4 粗酶液制備

從-70℃冰箱中接取保存于Eppendorf管中的菌種,接種于種子培養基中,于30℃,180 r·min-1的條件下培養12 h.然后,按1%的接種量接種于盛有50 m L基礎培養基的250 mL的三角燒瓶中,于30℃,180 r·min-1的條件下恒溫振蕩培養.最后,于離心機(10 000 r·min-1)中離心發酵液15 min,上清液即為粗酶液.

1.5 幾丁質酶酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[8]測定幾丁質酶的酶活力.取發酵液于4℃下離心(10 000 r· min-1)10 min,將0.5 mL上清液和1 mL的M cllvaine’s緩沖液與0.5 mL膠體幾丁質混合;于50℃中水浴反應1 h,煮沸10 min,離心(10 000 r·min-1)5 m in.取0.5 m L上清液加入0.5 m L的DNS,煮沸5 min,迅速冷卻,加入4 m L蒸餾水,于波長540 nm處測光密度值(D),結果為3次平行實驗的平均值.酶活力單位定義:在上述條件下,每分鐘產生1μmoL還原糖所需酶量為1個酶活力單位.

圖1 黏質沙雷氏菌產酶曲線圖Fig.1 Curve of chitimase p roduction output by S.marcesens

2 結果與討論

2.1 產酶曲線

將活化的液體種子接種于產酶培養基,間隔12 h取樣測定酶活力,其產酶曲線圖如圖1所示.

2.2 發酵工藝條件對黏質沙雷氏菌產酶的影響

2.2.1 培養時間 從圖1可知,黏質沙雷氏菌培養12 h后開始產幾丁質酶,至第48 h酶活力達到最高,以后逐步下降.

2.2.2 碳源 去除產酶培養基中的蛋白胨,分別以質量分數為0.5%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、幾丁質粉和膠體幾丁質作為碳源,其他成分不變.培養48 h后,測定幾丁質酶的酶活力(z),比較碳源對黏質沙雷氏菌產酶影響,結果如表1所示.從表1可知,在非幾丁質底物作用下,菌株不產生幾丁質酶.這表明,該幾丁質酶為誘導酶,且膠體幾丁質是該酶的高效誘導物.

2.2.3 氮源 在基礎培養基中,分別以質量分數為1%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素,(NH4)2SO4, NH4NO3,KNO3,N H4C1作為氮源,其他成分不變.培養48 h后,測定幾丁質酶活力(z),考察有機氮源和無機氮源對黏質沙雷氏菌產酶影響,結果如表1所示.從表1可知,有機氮對產酶有一定促進作用且以酵母粉為最佳,其他無機氮則對產酶具有一定的不利影響.

表1 碳源與氮源對黏質沙雷氏菌產酶的影響Tab.1 Effect of carbon and nitrogen sourceson chitinase p roduction by S.m arcescens

圖2 表面活性劑對黏質沙雷氏菌產酶的影響Fig.2 Effect of surfactantson chitinase p roduction by S.marcescens

2.2.4 表面活性劑 在基礎培養基中分別加入質量分數為0.02%的SDS,液體石蠟,Triton X-100,吐溫-80,山梨醇,PEG-8000,其他成分不變.培養48 h后,測定幾丁質酶活力,考察不同表面活性劑對黏質沙雷氏菌產酶的影響,結果如圖2所示.

從圖2可知,山梨醇對菌株的產酶水平有較為明顯的提高;PEG-8000對提高產酶的效果不明顯;而SDS、液體石蠟、Triton X-100及吐溫-80對該菌產幾丁質酶有一定抑制作用.這可能是,由于非離子表面活性劑與酶分子之間僅存在氫鍵和疏水作用,因而其抑制性較弱,但不同的表面活性劑間的抑制性仍有差別.

2.2.5 發酵溫度 將黏質沙雷氏菌于不同溫度環境下培養產酶,結果如圖3所示.從圖3可以看出,黏質沙雷氏菌在28～30℃時,產酶能力較為穩定.其中,在30℃時的產酶水平最高,而高于30℃,酶活力迅速降低.

2.2.6 初始p H值 將黏質沙雷氏菌于不同p H值環境下培養產酶,結果如圖4所示.從圖4可知,當培養基起始p H值為9.0時,酶活力最高;當p H值在8.5～11.0范圍內,該黏質沙雷氏菌產酶穩定;而當p H值低于8.5時,酶活力迅速下降.該菌耐堿性較好,但對酸性環境敏感.

圖4 起始p H值對黏質沙雷氏菌產酶的影響Fig.4 Effect of initial p H on chitinase p roduction by S.m arcescens

圖3 發酵溫度對黏質沙雷氏菌產酶的影響Fig.3 Effect of incubation temperature on chitinase p roduction by S.m arcescens

2.3 產酶培養基組分的優化

以培養基中膠體幾丁質、酵母粉、山梨醇,M gSO4,K2HPO4,KH2PO4為因素,進行均勻設計.在30℃,初始p H值為9.0,180 r·min-1下振蕩培養48 h后測定酶活力,結果如表2所示.表2中:X1～X6分別為膠體幾丁質,酵母粉,M gSO4,K2HPO4,KH2PO4,山梨醇的質量分數;Y為酶活力.用DPS V 7.05統計軟件進行回歸分析,可得回歸方程為

其中,相關系數R為0.974,經F值檢驗合格;顯著水平P為0.019(小于0.05),已達顯著水平.

根據回歸方程,當X1(膠體幾丁質)為0.504%,X2(酵母粉)為1.178%,X3(M gSO4)為0.025%, X4(K2HPO4)為0.095%,X5(KH2PO4)0.030%,X6(山梨醇)0.005%時,Y值(酶活力)達到最大值9.30μkat·L-1.3次重復試驗,酶活力達(9.30±0.67)μkat·L-1,接近預測值.

表2 培養基配方均勻設計表Tab.2 Uniform design table of the culturemedium components

2.4 發酵工藝條件的優化

以培養時間(A)、初始p H值(B)、發酵溫度(C)、裝液量(D)為考察因素,采用L9(34)表進行正交實驗,如表3所示.根據單因素考察接種量的影響,說明接種量對黏質沙雷氏菌誘導產酶沒有明顯影響.這可能是在營養豐富的環境中,黏質沙雷氏菌迅速增殖,由接種量不同所帶來的影響被很快持平.

由表3的極差值R可看出,4個因素中發酵時間影響最為顯著.各因素對試驗結果影響排名依次為A>B>D>C,其最優水平組合為:A2-B 3-C2-D 1.即培養時間為48 h、起始p H值為9.5,發酵溫度為30℃,250 m L三角瓶裝量為30 m L.

根據試驗結果分析選出的最優培養基和培養條件,進行3次搖瓶產酶驗證,均值為(9.39±0.83)μkat·L-1.這說明,優化后的參數是可靠的,比優化前酶活力(5.15 μkat·L-1)提高了81.6%.

3 結束語

采用均勻設計結合正交設計進行發酵條件優化,所得到酶活力最大值為9.39μkat· L-1,說明優化方法是行之有效的.該黏質沙雷氏菌產酶環境的最適p H值為9.5,耐堿能力較強,因此,利用該菌在鹽堿地上進行幾丁質廢料的降解有著誘人的前景.

表3 發酵工藝條件正交實驗結果Tab.3 O rthogonal-design result of the op timal culture conditions

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Culture Parameter Optim ization of Chitinase Production by Ser ratiama rcescens

SH I Teng-xin,L IU Jia,HE Yan-cai
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

Chitinase-p roducing Serratiam arcescens culturemedium components and culture conditionsof enzyme p roduction by shake flask fermentation were op timized with uniform-design and o rthogonal-design respectively.The results showed that the op timal component concentrations(m/m)were colloid chitin 0.504%,yeast extract 1.178%,M gSO4· 7H2O 0.025%,K2HPO40.095%,FeSO4·7H2O 0.001%,so rbitol 0.005%,KH2PO40.030%.The op timal culture conditionswere incubation time 48 h,temperature 30℃,initial p H 9.0,loadage 30 mL per 250 m L flask,inoculation quantity 1%.The activity of chitinase reached 9.39μkat·L-1w hich was increased by 81.6%than that of the unop timized conditions..

Serratiam arcescens;chitinase;unifo rm-design;o rthogonal-design

TQ 920.6;TQ 929+.2

A

(責任編輯:黃曉楠 英文審校:陳國華)

1000-5013(2010)06-0667-04

2009-01-04

賀淹才(1949-),男,教授,主要從事生物化學與分子生物學的研究.E-mail:yche@hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目(C04010011)