重組人血管內皮抑素與多西紫杉醇不同順序用藥調控移植瘤組織MMP及抗瘤效應觀察

袁靜 李凱

1971年Folkman教授提出了抗血管生成治療理論[1]，即腫瘤生長依賴新生血管，阻止其生成可阻斷腫瘤營養供應。近年來，一些抗血管生成藥物和化療聯合取得了較好療效，但兩種藥物的各自特點比較、聯合時的最佳用藥順序及分子機制等仍為亟待闡明的問題。本研究以荷瘤鼠為動物模型，采用重組人血管內皮抑素（恩度，rh-endostatin endostar）和多西紫杉醇（docetaxel）進行干預，通過觀察瘤組織基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）及其調控指標變化以及瘤組織微血管密度（microvessel density, MVD）和瘤體生長，對該問題進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及癌細胞株 BALB/c-nu/nu小鼠購自北京維通利華公司，4周齡-5周齡，雌性，體重16 g -18 g，于無菌條件下飼養。人肺癌A549細胞株由天津醫科大學腫瘤醫院免疫實驗室惠贈。

1.1.2 藥物和試劑 重組人血管內皮抑素由先聲藥業提供，批號：20081004。多西紫杉醇，由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，批號：08082311。基質金屬蛋白酶及其抑制劑、誘導劑染色所用一抗均購自Santa Cruz公司，CD34抗體購自Abcam公司。二抗及DAB等購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方法 A549細胞傳代培養于RPMI-1640培養液中，37oC、5%CO2條件下貼壁生長。

1.2.2 小鼠移植瘤模型的建立 調整細胞懸液濃度為5×107個/mL，于小鼠腹股溝皮下注射0.1 mL/只。待瘤體大于150 mm3時，剪成直徑2 mm的小塊，接種至小鼠左側腹股溝皮下形成移植瘤。

1.2.3 動物分組與給藥 第一階段：接種10天、成瘤體積達到要求后將實驗小鼠隨機分成2組，8只/組，配制好的多西紫杉醇以注射用水稀釋后腹腔注射，重組人血管內皮抑素以生理鹽水稀釋后于移植瘤對側皮下注射給藥。重組人血管內皮抑素組為重組人血管內皮抑素400 μg·d-1，d1-d14。多西紫杉醇組為多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d1-d14。小鼠均于第14天處死、收獲瘤塊。

第二階段：接種10天、成瘤體積達到要求后將實驗小鼠隨機分為3組，8只/組。重組人血管內皮抑素與多西紫杉醇給藥方法同前，生理鹽水皮下注射、注射用水腹腔注射給藥。同時用藥組為重組人血管內皮抑素400 μg·d-1，d1-d35；多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d1-d19。先重組人血管內皮抑素組為重組人血管內皮抑素400 μg·d-1，d1-d35；多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d16-d34。模型組為生理鹽水100 μL·d-1，d1-d35；注射用水200 μL·3d-1，d1-d35。所有小鼠均于第35天處死、收獲瘤塊。

將瘤塊浸泡于10%福爾馬林進行固定，隨后制成蠟塊，切片4 μm厚，用于免疫組織化學染色（immunohistochemistry, IHC）。

1.2.4 療效評價方法 測量瘤塊長徑a及短徑b、2/w，計算瘤體積：V=（a×b2）/2，抑瘤率=（1-治療組體積/模型組體積）×100%。

1.2.5 免疫組織化學染色方法 采用Envision兩步法檢測各指標的表達：常規脫蠟至水，高溫、高壓修復3 min，3%H2O2避光孵育15 min，加一抗（工作濃度為1:150），4oC過夜。二抗37oC孵育30 min，DAB顯色，復染核，中性樹膠封片。

結果判定：每張切片于高倍鏡（×400）下隨機選取8個-10個不重復的視野采集圖像，使用Image Pro Plus 6.0分析圖片，得到每張圖片的積分光密度值（integrated optical density, IOD），取平均值作為該切片的IOD（平均光密度和面積的乘積，可以全面反映蛋白表達量）。采用泛內皮標記物CD34標記血管并計算MVD，于鏡下（×400）選3個血管最豐富的視野計數，取其均數，厚壁血管及直徑較大者（＞8個紅細胞直徑）不計數。

1.3 統計學處理 以SPSS 15.0統計學軟件分析。正態分布的計量資料以Mean±SD表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析方法（ANOVA）中的LSD法；不符合正態分布的資料以中位數表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U法。符合正態分布的雙變量間的相關分析采用Pearson法，不符合正態分布的采用Spearman法進行統計。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 第一階段（單藥）

2.1.1 腫瘤生長及MVD比較 兩組瘤體積與MVD間差異均未見統計學意義（P=0.087, P=0.435），但多西紫杉醇組腫瘤體積小于重組人血管內皮抑素組，MVD高于重組人血管內皮抑素組（圖1，表1）。

2.1.2 各免疫組化指標比較 重組人血管內皮抑素組MMP-2、EMMPRIN表達低于多西紫杉醇組（P=0.024,P=0.081），兩組間TIMP-2表達未見明顯差異（圖2，表2）。

2.2 第二階段（聯合用藥）

2.2.1 腫瘤生長比較 治療結束后兩用藥組腫瘤體積均小于模型組（P＜0.01），兩用藥組間比較未見統計學差異（P=0.175）。治療第18天至第29天內，同時用藥組腫瘤體積均明顯小于先重組人血管內皮抑素組（P＜0.05），其早期抑制腫瘤生長作用更明顯（圖3，表3）。

2.2.2 各組免疫組化指標比較 兩用藥組的MMP-2表達及MVD顯著低于模型組（P＜0.05），兩用藥組間比較未見統計學差異；同時用藥組TIMP-2表達較先重組人血管內皮抑素組及模型組高（P=0.003, P=0.001），EMMPRIN表達較模型組低（P=0.018）。先重組人血管內皮抑素組TIMP-2、EMMPRIN表達與模型組比較未見統計學差異（表4，圖4）。

表 1 重組人血管內皮抑素組與多西紫杉醇組的瘤體積、MVD比較Tab 1 The comparison of tumor volume and MVD between the endostar group and the docetaxel group (Mean±SD, M)

表 2 兩單藥組MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表達情況比較Tab 2 The comparison of the expression of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN between single-drug groups

表 3 同時用藥組、先重組人血管內皮抑素組與模型組治療前、后瘤體積變化比較Tab 3 Comparison of the changes of tumor volume during therapy among the concurrent administration group, endo-first group and model group (Mean±SD, n=8)

表 4 同時用藥組、先重組人血管內皮抑素組、模型組移植瘤的各組化指標染色結果比較Tab 4 Comparison of the dyeing result among concurrent administration group, endo-first group, and model group (Mean±SD, n=8)

圖 1 重組人血管內皮抑素組與多西紫杉醇組t移i植me瘤生長曲線Fig 1 Growth curves of transplanted tumor of Rh-endostatin group and docetaxel group

圖 2 重組人血管內皮抑素組與多西紫杉醇組MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表達（IHC, ×400）Fig 2 The expressions of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN in the endostar group and docetaxel group (IHC, ×400). A, B, C:MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN expression of the Rh-endostatin group in turns； D, E, F: MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN expression of the docetaxel group in turns.

圖 3 同時用藥組、先重組人血管內t皮i抑m素e組、模型組的移植瘤生長曲線Fig 3 Growth curves of transplanted lung tumor of the concurrent administration group, endo-first group and model group

2.3 相關分析 瘤體積與MVD呈明顯正相關（r=0.529,P=0.017），TIMP-2與腫瘤體積呈負相關（r=-0.558,P=0.015）。

3 討論

研究[2]證實，抗血管生成與化療藥物聯合治療肺癌可以取得良好療效，故常將以上兩種藥物聯合使用。但如何找到二者的最佳搭配模式仍是爭論熱點。Huang等[3]認為，抗血管生成藥物可將原本排列混亂的腫瘤血管網“梳理整齊”，暢通血流，令更多藥物和氧進入，提高腫瘤對藥物的敏感性。據此“血管正常化”假說，最佳次序應為抗血管生成先于化療。但有些研究人員認為，“血管正常化”僅僅是一個短暫過程，不能對療效產生重大影響；反之，先使用化療大量殺傷腫瘤后再行抗血管生成治療才可帶來最大臨床受益。目前以此模式完成的Avastin與化療聯合治療肺癌的試驗即獲得了滿意效果[2]。因此，亟需比較兩種模式的不同療效，并闡明機制，為確立最佳治療方案提供依據。

MMPs是迄今為止發現的與腫瘤侵襲關系最為密切的一類蛋白水解酶，可降解細胞外基質（extracellular matrix, ECM）、增加毛細血管通透性，促進液體滲入組織間、壓迫毛細血管、使其逐漸膨脹、迂曲，血管網排列也變得混亂。故在諸多血管生成因子中，其與“血管混亂化”的關系最為密切。理論上講，抑制其表達或功能最可能將原本混亂的腫瘤血管重新排列“正常化”。

圖 4 同時用藥組、先重組人血管內皮抑素組和模型組各染色指標表達情況比較（IHC, ×400）。1-4依次為MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN及MVD表達情況；A：同時用藥組；B：先重組人血管內皮抑素組；C：模型組。Fig 4 The comparison of the expression of each staining index among concurrent administration group, endo-first group, and model group (IHC, ×400). 1-4 were the expression of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN and MVD in turns； A: Concurrent administration group； B: Endo-first group； C: Model group.

MMPs的表達受其抑制劑TIMPs（matrix metalloproteinase inhibitors, TIMPs）及誘導劑EMMPRIN的調節。MMP-2屬于IV型膠原酶，在肺癌組織的表達明顯高于正常肺組織[4]，其抑制因子TIMP-2是一種非糖蛋白，與MMP-2的親和力很強，主要抑制其活性，但對MMPs家族其它成員也有作用。ECM的降解并不是由MMPs分泌的多少來決定，而是由MMPs/TIMPs的平衡決定[5]。MMP-2的誘導因子EMMPRIN（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）又稱CD147，能誘導MMPs產生[6]、與腫瘤血管生成有密切關系[7,8]。

Kim等[9]發現血管內皮抑素可與MMP-2前體蛋白（pro-MMP2）結合形成穩定復合體而阻止其活化、并抑制MMP-2和膜型MMP（MT1-MMP）的催化活性。也有研究[10]發現，重組人血管內皮抑素對MMP-2的抑制作用比對MMP-9的明顯，可能是通過抑制ERK1/2磷酸化引起MMPs下調。多西紫杉醇也可明顯抑制MMP-2[11]。

重組人血管內皮抑素由我國自主研發，其III、IV期臨床試驗均證明它對化療藥物有明顯的增效作用。我們選用其和多西紫杉醇進行藥物干預，旨在比較二者的抗腫瘤特點，闡明聯合用藥時的最佳順序及分子機制，為制定臨床治療方案提供依據。

實驗第一階段比較兩藥的各自效應，結果重組人血管內皮抑素組MMP-2、EMMPRIN表達低于多西紫杉醇組（P=0.024, P=0.081），雖兩組的瘤體積與MVD間差異未見統計學意義（P=0.087, P=0.435），多西紫杉醇組腫瘤體積小于重組人血管內皮抑素組，MVD卻高于重組人血管內皮抑素組；提示盡管前期研究已證實兩藥均可抑制MMP-2表達，但重組人血管內皮抑素通過下調EMMPRIN抑制MMP-2表達的作用更強，并可能更多地降低MVD。但這一“抑瘤潛力”卻未能轉化成良好效果、導致瘤體迅速生長。反之，盡管多西紫杉醇抑制MMP-2的作用可能弱于重組人血管內皮抑素，但由于其細胞毒作用而更有效地抑制了瘤體增大。因此，重組人血管內皮抑素抑制新生血管形成的能力雖然更強，但因對腫瘤細胞無顯著殺傷、從而不能與化療藥物匹敵并取得良好療效，利用其特點為化療藥物增效應更合理。因此，在第二階段觀察了聯合用藥效果及最佳治療順序。由于在第一階段中重組人血管內皮抑素用藥14天后觀察到EMMPRIN、MMP-2明顯下調，提示已達到穩定抑制MMP的狀態，因此設定先重組人血管內皮抑素組重組人血管內皮抑素單藥的作用時間為14天。

實驗發現，兩聯合用藥組MMP-2的表達均低于模型組，但同時用藥組EMMPRIN表達明顯低于先重組人血管內皮抑素組及模型組，并上調了TIMP-2表達，致使MMPs/TIMPs平衡改變、ECM降解減少，有效地降低了腫瘤血管通透性和組織間流體靜壓（interstitial fluid pressure, IFP）、減輕滲出液壓迫微血管、達到“血管正常化”，使更多藥物進入瘤體、為同時應用的化療增效[3]，腫瘤體積也得以明顯縮小。我們推測，同時用藥組EMMPRIN和TIMP-2變化應歸咎于早期聯合用藥迅速壓制了腫瘤生長、使其分泌的腫瘤性促血管生成因子（tumoral angiogenesis factors, TAFs）減少，從而下調EMMPRIN的表達而上調TIMP-2表達（VEGF可抑制TIMP-2基因及蛋白表達[12]）。反之，先使用重組人血管內皮抑素盡管可能達到抑制MMP-2表達、促進“血管正常化”的作用，但因沒有能有效殺傷腫瘤細胞的藥物同期通過“正常化”的血管進入瘤體、發揮功效，致使腫瘤繼續生長、產生大量TAFs（如VEGF），全面促進腫瘤組織的血管內皮細胞增殖、活化及新生血管形成、增加血管通透性，這些作用可能部分、甚至全部抵消了MMP下調對腫瘤血管的作用，使其恢復為密集而混亂的狀態。因此，雖然兩種給藥順序均可通過MMPs環節起到抗腫瘤作用，但顯然只有保證兩藥作用緊密銜接，方能充分發揮重組人血管內皮抑素的“增效潛力”。但也可能因為本組單藥重組人血管內皮抑素給藥時間較長（14天），導致其作用未能與多西紫杉醇很好銜接而降低了效果。假如找到更合適的重組人血管內皮抑素作用時間窗，緊密銜接兩藥作用，或可達到更好療效。

本研究從MMPs及其抑制劑、誘導劑的角度探討了兩種用藥順序的不同作用機制，為臨床用藥提供了一定的理論依據，也從基礎研究角度驗證了在ECOG4599、AVAIL、YH-16等國內、外臨床試驗中同時用藥模式的合理性。但腫瘤生長是多步驟、多環節的復雜過程，對其它指標、通路的研究有待繼續進行。