鴨禽流感抗體血凝抑制試驗 (HI)的適用性改進

張 存，王一成，孫小梅，俞元明，袁秀芳，葉偉成，劉蔓雯

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江省湖州眾旺禽業有限公司，浙江 湖州 313014;3.桐鄉市烏鎮鎮農業經濟服務中心，浙江 桐鄉 314501)

1990年代以來，高致病性禽流感 (avian influenza)H5N1亞型的變異毒株可以導致鴨和番鴨發病死亡，疫苗免疫已經成為該病防控的主要措施之一［1］。在研究工作和畜牧生產上必須開展大量的鴨和番鴨等水禽禽流感抗體檢測和監測以評價疫苗免疫效果，血凝 (HA)和血凝抑制試驗(HI)是最常用的方法。我國檢測高致病性禽流感HI抗體的標準方法以雞紅細胞作為HI試驗的凝集抑制指示細胞［2］，在檢測水禽血清抗體時，常常出現非特異性凝集現象，干擾檢測結果的判定［3］。因此我們開展了禽流感抗原凝集鴨和番鴨紅細胞特性的檢測、不同 (品)種鴨紅細胞與血清交叉凝集試驗，確定了櫻桃谷鴨紅細胞代替雞紅細胞進行HI試驗，并和RDE處理等方法進行了比較。

1 材料和方法

1.1 抗原和血清

高致病性禽流感 HI抗原 (批號2005061104)和陽性血清由哈爾濱獸醫研究所生產。番鴨、櫻桃谷肉鴨和麻鴨血清采集自杭州市華東家禽交易市場，每種4～6群，每群隨機采集8～10只。

1.2 紅細胞 (RBC)懸液的制備

采集非免疫3只成年伊莎公雞或者櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨血液，與等量阿氏液 (葡萄糖20.5 g·L－1，檸檬酸鈉 8 g·L－1，檸檬酸 0.55 g·L－1，氯化鈉 4.2 g·L－1，pH 值 6.1)混合后，以 PBS(0.01 mol·L－1，pH 值 7.2)洗滌 3～4次以除去血漿和白細胞，每次均以1 000 r·min－1離心 10 min，紅細胞沉淀以 PBS配置成1%的懸液［2］。

1.3 血清受體破壞酶 (RDE)處理

按文獻方法處理麻鴨、番鴨和櫻桃谷肉鴨血清各20份，以雞紅細胞進行HI試驗，并與鴨紅細胞作對比。RDE處理鴨血清的具體程序為:0.3 mL RDE(由浙江省疾病防控中心盧亦愚教授惠贈)與0.1 mL血清混合，37℃水浴過夜，56℃ 30 min滅活，再加入0.6 mL PBS使血清稀釋為1∶10。

1.4 血凝和血凝抑制試驗方法

按照文獻［2］操作。結果判定:血凝被完全抑制的血清最大稀釋度為血凝抑制試驗的終點，該孔稀釋度的倒數即為HI試驗的效價。

2 結果和分析

2.1 AIV抗原對雞鴨紅細胞的凝集效價

以雞紅細胞 (CRBC)、番鴨紅細胞(mDRBC)、櫻桃谷鴨紅細胞 (yDRBC)和紹興鴨紅細胞 (sDRBC)進行HA試驗，結果表明，H5亞型AIV標準抗原對4種家禽的紅細胞凝集效價完全一致，均為8log2(表1)。

表1 AIV H5N1抗原凝集雞鴨紅細胞效價比較

2.2 鴨血清對雞紅細胞和鴨紅細胞的凝集比較

將4個番鴨血清樣品、6個麻鴨血清樣品、5個櫻桃谷肉鴨血清樣品和2個AIV標準陽性血清(雞)倍比稀釋后與紅細胞懸液等量混合，室溫保持30 min觀察紅細胞凝集現象。結果發現4只番鴨血清、6個麻鴨血清中有3個樣品與CRBC出現1～3孔 (2～8倍稀釋)凝集或者可疑凝集，櫻桃谷肉鴨血清未出現凝集CRBC的現象。而雞的血清可以凝集 yDRBC，即使16倍稀釋后也可出現凝集。番鴨、麻鴨、櫻桃谷肉鴨血清與yDRBC混合后均未見到凝集現象 (表2)。因此，以雞紅細胞測定番鴨、麻鴨血清或者以鴨紅細胞測定雞血清的AIV HI效價將會出現非特異性凝集的干擾，可以使用yDRBC代替CRBC測定番鴨、麻鴨和櫻桃谷鴨的AIV HI抗體。

此外，以yDRBC測定番鴨、麻鴨禽流感的HI效價與本種動物紅細胞測定的效價一致，未見差別。

表2 鴨血清對雞、櫻桃谷鴨紅細胞的凝集效果

2.3 yDRBC測定鴨血清 HI抗體與 RDE處理的比較

紹興鴨、櫻桃谷鴨和番鴨血清各20個樣品經過RDE處理后以 CRBC進行 HI試驗，同時以yDRBC進行測定，檢測結果 (表3)顯示:(1)櫻桃谷鴨和番鴨血清樣品符合率 (以±1個滴度視為符合)均達到100%，紹興鴨樣品符合率為80%;(2)2種方法檢測的20個樣品平均滴度相差櫻桃谷0.2log2，番鴨0.1log2，紹興鴨差別最大為0.75 log2;(3)對于高抗體滴度的血清樣品檢測結果，2種方法差異較小，低抗體樣品稍大。此外，即使經過 RDE處理，沉底的紅細胞 (不凝集)流動性仍然很差，終點判定較為困難，而使用櫻桃谷鴨紅細胞可以容易地根據紅細胞的流動性來判定結果。

表3 2種檢測鴨AIV 抗體血凝抑制試驗方法比較

2.4 RDE處理和CRBC吸附對鴨血清HI檢測結果的影響

以yDRBC檢測鴨血清AIV HI抗體水平，與經過RDE處理和CRBC吸附后的檢測結果相比，紹興鴨HI抗體平均滴度基本一致，而櫻桃谷鴨和番鴨血清分別高0.7log2和0.8log2，因此以 yDRBC進行HI試驗檢測鴨血清，其敏感性略高于CRBC。鴨血清即使經過CRBC吸附處理，仍然不能完全消除其對CRBC的非特異性凝集作用。

表4 雞紅細胞吸附對鴨血清HI抗體檢測結果的影響

2.5 上市鴨群部分血清樣品H5 HI滴度分布

對市場采集的部分肉用鴨高致病性禽流感抗體進行了檢測，結果 (表5)顯示:紹興鴨公鴨、櫻桃谷肉鴨和番鴨的H5N1亞型禽流感HI抗體合格率 (≥4log2)分別為100%、98%和100%，平均滴度分別為 5.94log2、5.1log2和 6.82log2，表明禽流感疫苗免疫效果很好，上市時抗體合格率幾乎達到100%。

表5 上市肉鴨H5N1抗體檢測分布和合格率

3 小結與討論

HA和HI試驗是我國檢測禽流感抗體的標準方法，在科研、教學和生產上廣泛采用。禽流感病毒表面的HA蛋白可以和動物紅細胞表面的受體結合引起紅細胞凝集，因此可以根據阻斷這種凝集紅細胞的血清稀釋度來判定血清中抗體的含量。

不同動物的血清和紅細胞之間可能存在影響凝集的因素［3］，如雞紅細胞和鴨血清就會出現非特異性的凝集，相反鴨紅細胞和雞血清之間也會出現非特異性的凝集現象。因此為了保證HI試驗結果的可靠性，必須消除血清中非特異性的影響因子。RDE處理待檢血清一般可以消除異種動物血清的非特異性凝集因子，但RDE處理方法耗時、昂貴，不適合大量檢測;將血清以紅細胞吸附后進行HI試驗，但非特異性凝集因子消除不完全。本試驗對麻鴨、櫻桃谷肉鴨和番鴨血清與紅細胞進行了交叉凝集試驗，發現同種動物的紅細胞與血清間不存在非特異性凝集現象，這和張評滸等［3－4］的研究結果一致。但在禽流感的實際監測過程中，存在番鴨、肉鴨以及蛋鴨等不同種或品種，需要采集和使用不同 (品)種鴨的紅細胞，如果能夠使用一種紅細胞即可檢測各 (品)種鴨的 HI抗體，將增加HI方法的易用性和便利性，試驗分別比較了櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨之間血清和紅細胞的交叉凝集現象，結果發現鴨種間不存在血清和紅細胞的交叉凝集現象，可以使用鴨紅細胞懸液進行鴨、番鴨血清抗體的HA和HI試驗。

采用櫻桃谷鴨紅細胞檢測紹興鴨、櫻桃谷鴨和番鴨血清，能夠消除鴨血清非特異性凝集雞紅細胞對HI抗體檢測結果的影響，凝集圖象清晰，可以通過紅細胞的流動性來判定結果 (即將血凝板傾斜45o角并保持5 s，不凝集的沉底紅細胞會流動)結果易于判定，減少了HI試驗結果判定的主觀性;而以雞紅細胞檢測鴨和番鴨血清的HI抗體，即使血清經過RDE處理、紅細胞吸附，仍然不能完全消除這種非特異性凝集作用，不凝集的紅細胞也無流動性，在終點判定時比較困難，干擾結果的判定。檢測不同品種鴨和番鴨的血清抗體僅僅使用櫻桃谷肉鴨紅細胞即可，而不必制備多種鴨紅細胞，在水禽禽流感抗體檢測和監測中具有重要的應用價值。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京.北京農業大學出版社，2002.

［2］GB/T 1836－2003高致病性禽流感診斷技術 ［S］.

［3］張評滸，唐應華，仇旭升，薛峰，等.不同家禽紅細胞懸液對禽流感血清抗體檢測的影響［J］.中國獸醫科技，2005，35(4):267－271.

［4］李金華，葉偉成，王一成，等.雛鴨禽流感母源抗體消長動態測定［J］.浙江畜牧獸醫，2008(2):1－2.