河北省番茄黃化曲葉病毒病的分子鑒定初報

周 瑩, 李興紅, 劉建華, 姜京宇, 王曙峰, 燕繼曄*

(1.北京市農林科學院植保環保所,北京 100097; 2.河北省植保植檢站,石家莊 050011;3.河北省邯鄲市農業局,056002)

雙生病毒是一類廣泛發生的植物單鏈環形DNA病毒[1],其成員可以侵染單子葉和雙子葉的草本或木本的多種重要經濟作物,通常以煙粉虱為介體以持久性方式傳播[2].雙生病毒基因組多由DNA-A和DNA-B 2個組分組成,有些病毒為單組分,基因組只含DNA-A[3],單組分雙生病毒還常伴隨衛星DNA[4-5]。DNA-A組分一般編碼4～6個開放閱讀框(ORFs)[6]。

目前,雙生病毒已廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲、南美的加勒比海岸及北美的墨西哥和美國等世界各地。已有20多個國家的番茄、木薯、棉花、煙草等作物遭受這類病毒的毀滅性危害[7-8]。20世紀70年代后期,中東地區所有的番茄產地皆受到雙生病毒的危害[9]。1990年多米尼加95%的番茄受到雙生病毒的毀壞。1991-1992年該類病毒在美國佛羅里達的番茄上造成的損失達上億美元[7]。

自20世紀90年代起,在我國云南、廣西、廣東、海南等地的煙草、番茄和南瓜等多種作物上相繼發現了雙生病毒且其危害逐年加重[10-15],在云南,雙生病毒引起的香料煙曲葉病在局部田塊病株率達70%以上,導致煙草產量、品質的嚴重損失。在廣西的番茄和番木瓜上,雙生病毒發病也很普遍,發病嚴重地區病株率高達30%～50%,損失慘重。

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,T YLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),是雙生病毒科中侵染番茄的一種重要病害,主要通過煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播,可以侵染茄科、豆科等多種植物。由T YLCV引起的番茄黃化曲葉病毒病是一種毀滅性病害,苗期染病減產80%,甚至絕收,成株期染病也會造成嚴重減產,已成為世界許多地區番茄生產的重要限制因素。自1964年 TYLCV被正式命名以來,已在中東、東南亞、東亞、非洲等眾多的國家和地區發現。近年來該病在我國已逐步由南向北擴展,發生蔓延的速度極快。在中國的浙江、廣東、廣西、江蘇、上海、云南、重慶、福建、海南、臺灣等地已有發現[16-24],對當地的番茄生產形成了嚴重威脅,從發病蔓延趨勢看,該病的迅速蔓延與暴發將會對我國的番茄產業產生嚴重影響。因此應加強對這類病毒變異的了解和調查,避免因種植品種單一而造成病害的大發生。

2009年4月作者在河北省魏縣橫王村發現具有疑似雙生病毒侵染癥狀的番茄病株,為了確證是否由雙生病毒所致,作者利用PCR方法對感病番茄樣品進行了病原分子鑒定,并對所得分離物的核酸序列變異情況進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣品

4個病毒樣品均采自于河北省魏縣,田間病株表現為葉片皺縮、卷曲、褪綠、植株矮化等癥狀,編號為F11、F12、F13和F14。陽性對照樣品為江蘇番茄病樣,經測序確認感染了雙生病毒。

1.1.2 主要試劑

基因組 DNA快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒為蓋寧生物科技(北京)有限公司產品;dNTPs、Ex Taq酶為TaKaRa公司產品;載體 pGEM-T Vector SystemI、T4連接酶為Promega公司產品;大腸桿菌(Escherichia coli)TOP 10購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用基因組DNA快速提取試劑盒,按照試劑盒說明進行操作。

1.2.2 引物合成

參照GenBank中已報道危害番茄的雙生病毒DNA-A序列,通過BlastN比對,根據其序列保守區,設計了1對簡并引物,引物序列分別為:SSF15′-GATTGCADAGGAAGATAGT-3′(位 于 1708～1726 nt),SSP15′-GCACAATTWCCATCCRAAC-3′(位于 2367～2348 nt)(其中 R=A/G,W=A/T,D=A/G/T),引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應體系:10×PCR反應緩沖液5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)4 μ L,20 μ mol/L 上下游引物各2 μ L,Ex Taq 酶 0.5 μ L,基因組 DNA 3 μ L,加 ddH2O至總體積為 50 μ L。充分混勻后于BioRadC-1000PCR儀上進行反應。反應程序:94℃預變性4 min;94℃變性45 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環。72℃延伸5 min。反應完畢后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。PCR反應以江蘇番茄病樣為陽性對照,以健康植株為陰性對照。擴增產物割膠后使用蓋寧生物科技(北京)有限公司瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒進行DNA回收純化。

1.2.4 克隆與測序

PCR回收產物與載體按pGEM-T Vector SystemI反應體系在25℃下反應 1 h。取6 μ L連接產物轉化大腸桿菌TOP 10,涂布在具有氨芐青霉素抗性的LB(Luria-Bertani)固體培養基(氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL)平板上,37 ℃培養 12～16 h。挑取單菌落于氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養基中,搖床培養過夜。提取質粒,經陽性克隆鑒定后測序。測序由博邁德科技發展有限公司完成。

1.2.5 序列分析

所得分離物序列利用DNAMAN軟件和NCBI Blast進行比較分析序列。

2 結果

2.1 田間病害癥狀及危害

番茄植株感病后主要表現為植株生長遲緩、節間變短、明顯矮化;葉片變小、變厚、有褶皺、向上卷曲以致變形;葉片邊緣至葉脈區域黃化等癥狀(圖1)。

圖1 感病番茄癥狀表現

2.2 PCR分子鑒定結果

用SSF1、SSR1簡并引物進行 PCR擴增,從F11、F12、F13和F14樣品的總 DNA中均擴增到了約660 bp的DNA特異片段(圖2),與從侵染雙生病毒的番茄樣品擴增條帶的大小一致,從番茄健康植株中未擴增到此條帶,表明F11、F12、F13和F14樣品可能感染了雙生病毒。

2.3 序列分析

將F11、F12樣品中擴增到的特異性片斷進行克隆測序,獲得4條不同序列,長度均為662 bp,序列間相似性為 99.90%(圖 3)。利用 NCBI中BlastN進行檢索,相似性高的均為TYLCV分離物,其中與登錄號FJ646611.1山東TYLCV分離物相似性最高,達99.25%～99.55%。擴增片斷為位于互補鏈上的AC1基因的部分序列,序列分析結果說明此部分序列在各分離物之間變異不大,保守性較好,因此SSF1/SSR1引物對河北地區T YLCV的分子檢測具有一定的參考價值。

圖2 番茄病樣雙生病毒的PCR檢測

圖3 TYLCV河北分離物部分核酸序列分析

3 討論

由TYLCV引起的番茄黃化曲葉病毒病已成為世界許多地區番茄生產的重要限制因素。近年來在我國已逐步由南向北擴展,發生蔓延的速度極快。從發病蔓延趨勢看,在一兩年內,該病極有可能蔓延到周邊地區,將會對番茄產業產生嚴重影響。鑒于這類病毒的危害逐年擴大,了解粉虱傳雙生病毒在河北的發生、流行動態以及該病毒在本區域的變異情況,對于有效控制該病害蔓延和危害具有重要意義。

本試驗檢測結果表明在河北地區表現葉片卷曲、植物矮化癥狀的番茄樣品為番茄黃化曲葉病毒(T YLCV)陽性,初步認為該病毒病在該地區已發生,從獲得的TYLCV部分基因組序列看出,AC1基因部分變異不大,對于獲得河北T YLCV分離物全基因組序列,進而研究該病毒變異情況具有一定的借鑒意義。

[1] Harrison B D,Barker H,Bock K R,et al.Plant viruses with circular single-stranded DNA[J].Nature,1977,270:760-762.

[2] Harrison B D,Robinson D J.Natural genomic and antigenic variation in whiefly-transmitted geminiviruses(Begomoviruses)[J].A nnual Review of Phy topathology,1999,37:369-398.

[3] Fauquet C M,Mayo M A,Maniloff J,et al.VIIIth report of the international committee on taxonomy of viruses[M].San Diego:Elsevier Academic Press,2005.

[4] Saunders K,Bedford I K,Briddon R W,et al.A unique virus complex causes ageratum yellow vein disease[J].Proceedings of the National AcademyofSciences(USA),2000,97:6890-6895.

[5] 謝艷,周雪平,李正和,等.與煙草曲葉病毒伴隨的新型 DNA分子鑒定[J].科學通報,2002,47(10):768-771.

[6] Lazarowitz D G.Geminiviruses:genome structure and gene function[J].Critical Reviews in Plant Sciences,1992,11(4):327-349.

[7] Morione E,Navas-Castillo J.Tomato yellow lea f curl virus,an emerging virus complex causing epidemics worldwide[J].Virus Research,2000,71:123-134.

[8] Hanley-Bowdoin L,Settlage S B,Orozco B M,et al.Geminiviruses:Models for plant DNA replication,transcription,and cell cycle regulation[J].Critical Reviews in Plant Sciences,1999,18:71-106.

[9] Czosnek H,Laterrot H A.worldwide survey of Tomato leaf curl viruses[J].A rchives of Virology,1997,142:1391-1406.

[10]洪益國,蔡健和.煙草曲葉雙生病毒的分子進化的初步研究[J].科學通報,1994,39:165-168.

[11]劉玉樂,蔡健和,李冬玲.中國番茄黃化曲葉病毒-雙生病毒的一個新種[J].中國科學C輯,1998,28:148-153.

[12]謝艷,周雪平,張仲凱,等.從云南分離的煙草曲頂病毒為菜豆金色花葉病毒屬的一個新種[J].科學通報,2001,46:1459-1462.

[13] Xie Y,Zhou X P.Molecular characterization of Squash leaf curl Yunnan virus,a new begomovirus and evidence for recombination[J].Archives of Virology,2003,148:2047-2054.

[14]謝艷,張仲凱,李正和,等.粉虱傳雙生病毒的TAS-ELISA及PCR快速檢測[J].植物病理學報,2002,32(2):182-186.

[15]張仲凱,丁銘,方琦,等.粉虱傳雙生病毒在云南的發生分布[J].云南農業大學學報,2002,17(4):450-451.

[16]Wu J P,Dai F M,Zhou X P.First report of Tomato yellow leaf curl virus in China[J].PlantDisease,2006,90(10):1359.

[17]何自福,虞皓.警惕廣東番茄煙粉虱傳雙生病毒病的發生[J].廣東農業科學,2003(4):41-43.

[18]何自福,虞皓,羅方芳.番茄煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測[J].中國病毒學,2004,19(1):67-69.

[19]張穗,王冬生,瞿培榮,等.上海市番茄黃化曲葉病毒(T YLCV)病的初步鑒定[J].上海農業學報,2006,22(3):126.

[20]吳永漢,張純胄,許方程,等.溫州地區番茄曲葉病毒病發生與防治[J].中國蔬菜,2007(5):57-58.

[21]王冬生,匡開源,袁永達,等.番茄黃化曲葉病毒在上海發生流行的初步觀察[J].上海蔬菜,2007(4):61-62.

[22]趙統敏,余文貴,周益軍,等.江蘇省番茄黃化曲葉病毒病(T YLCD)的發生與診斷初報[J].江蘇農業學報,2007,23(6):654-655.

[23]葉青靜,楊悅儉,王榮青.應用PCR方法檢測煙粉虱傳雙生病毒[J].植物保護,2008,34(6):25-28.

[24]Mugiira R B,Liu S S,Zhou X.Tomato yellow leaf curl virus and Tomato leafcurlTaiwan virus invade south-east coastof China[J].Journal of Phytopathology,2008,156(4):217-221.