銅綠假單胞菌mexA基因的克隆及其序列分析

程小平，沈定霞，羅燕萍，周 光，陳 榮，權秋寧

（1、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、中國人民解放軍總醫(yī)院微生物科；3、南昌大學醫(yī)學院06級檢驗系）

銅綠假單胞菌mexA基因的克隆及其序列分析

程小平1，沈定霞2*，羅燕萍2，周 光2，陳 榮2，權秋寧3

（1、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、中國人民解放軍總醫(yī)院微生物科；3、南昌大學醫(yī)學院06級檢驗系）

目的 克隆銅綠假單胞菌臨床菌株mexA基因并進行序列分析。 方法 從臨床分離多重耐藥的銅綠假單胞菌抽提DNA，經(jīng)PCR擴增出mexA基因與PUC18克隆載體連接，對重組質(zhì)粒進行測序驗證。 結果 成功地克隆了mexA基因，重組質(zhì)粒(PUC/mexA)經(jīng)測序與Genebank檢索的mexA基因序列進行對比證實為99.9%同源 。 結論 所構建的銅綠假單胞菌臨床菌株mexA基因克隆適于進一步的克隆表達。

銅綠假單胞菌，mexA基因，克隆，序列分析

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)內(nèi)存在著多種主動外排系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠主動將擴散進細菌細胞中的抗菌藥物泵出細胞外，從而使細菌獲得耐藥性。進一步研究表明，PA對碳青酶烯類抗生素的高度耐藥與其存在的主動外排系統(tǒng)密切相關[1]。隨著新的主動外排系統(tǒng)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)及其在臨床主要病原菌耐藥中的重要作用不斷被揭示和認同，主動外排系統(tǒng)成為目前細菌耐藥機制研究中的新熱點[2]。目前已明確的導致銅綠假單胞菌多重耐藥性的主動外排泵系統(tǒng)共分為：MexAB-OprM[3]，MexCD-OprJ[4]，MexEF-OprN[5]，MexXY-OprM[6]，MexJK-OprM[7]，MexGHI-OprJ[8]，MexVW-OprM[9]。MexAB-OprM在所知的多藥外排泵中具有最廣的底物特異性，包括β-內(nèi)酰胺類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類、四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、新生霉素類、磺胺類及甲氧芐氨嘧啶。為了構建基因工程抗體，本文從臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌擴增和克隆出mexA基因，并測定和分析了其全部核苷酸序列，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒標準菌株 ：P.ueruginosa PAO4290 lue-10，argF10，aph-9004，F(xiàn)PP.aeruginosa TNP 030#10 OFLX and CFS-resistant日本 TaiJi Nakae教授惠贈；臨床銅綠假單胞菌菌株：中國人民解放軍總醫(yī)院微生物科提供。質(zhì)粒PUC18購自Takara公司。

1.2 酶類及主要試劑 限制性內(nèi)切酶XbaⅠ，HindⅢ為Takara公司產(chǎn)品；小量膠回收試劑盒為華舜公司產(chǎn)品；T4 DNA ligase為Takara公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 引物設計 設計擴增mexA基因的引物兩條，mexA基因的上游引物 ABM F5’-GC TCTAGA CAATCGAGCTCGCTCTGG-3’，引入了XbaⅠ酶切位點。下游引物ABM R5’-GCC AAGCTT TCAGCCCTTGCTGTCGG-3’，引入了HindⅢ酶切位點。引物由上海生工公司合成。

2.2 模板提取 用無菌吸管挑取銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵過度表達菌株（P.aeruginosa TNP030#10）和臨床銅綠假單胞菌菌株的單個菌落，放于含100μl去離子水的Eppendorf管中，100℃煮10min，10,000rpm離心10min，吸取上清液50μl，作為DNA模板 ，-20℃冷藏備用。

2.3 PCR擴增獲取mexA基因 以提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體積50μl：5.0μl緩沖液（10×）、5.0μl dNTP（10mmol/L）、引物1和引物2各 3.0μl(2.5μmol/L)、模板 4.0μl、高保真酶 2U、MgCl23.0μl(25mmol/L)和水26μl，混勻，置PCR儀（PER kin ELMER DNA Thermal·cycler 480）上擴增，95℃總變性5min，94℃變性 30s，65℃退火 45s，72℃延伸90s，35次循環(huán)反應后，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物上樣于1.0%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)電泳。

2.4 克隆和DNA序列分析 取PCR產(chǎn)物電泳，用凝膠回收試劑從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物。連接反應體系10μl：7.0μl PCR產(chǎn)物、PUC18酶切產(chǎn)物1μl、T4 DNA ligase 1μl、10x T4 Buffer 1μl，16℃18h，向連接液中加入200μl感受態(tài)Ecoli DH 5α菌轉(zhuǎn)化，然后接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中，37℃過夜培養(yǎng)，挑取菌落進一步培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，用XbaI與HindⅢ雙酶切，然后電泳分析結果。將含有重組質(zhì)粒（PUC18/mexA）的菌株送上海生工公司進行DNA序列分析。

結果

圖1 MexA基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

1 PCR擴增產(chǎn)物(MexA基因 圖1)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Markers為分子量標準參考物，可見PCR產(chǎn)物全長 1.5 kb，與預期長度一致。

圖2 重組質(zhì)粒PUC18/mexA酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2 mexA基因克隆酶切鑒定結果(圖2)將PCR擴增目的基因mexA與PUC18載體連接，重組質(zhì)粒（PUC18/mexA）經(jīng)XbaⅠ/HindⅢ酶切，1.0%瓊脂凝膠電泳，出現(xiàn)2.67kb載體大片段和1.5kb的mexA片段。

3 序列分析和同源性比較結果 含有重組克隆質(zhì)粒PUC18/mexA的菌株委托上海生工公司行DNA序列分析，序列為：

序列分析結果表明，重組質(zhì)粒含有1500bp的mexA基因序列，與GeneBank中PAo1mexA基因序列比較在基因大小上完全一致；只有兩個堿基不同，392位的堿基由T變?yōu)锳，1352位的堿基由G變?yōu)锳，但對應的氨基酸沒有變化。

討論

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）所涉及耐藥機制相當復雜，包括抗生素滅活酶或修飾酶的生成、外膜低滲透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主動外排等[10]。MexAB-OprM是在PA中發(fā)現(xiàn)的第一個RND家族外排系統(tǒng)，在PA對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素（包括碳青霉烯類)的固有耐藥機制中發(fā)揮重要作用，MexAB-OprM是迄今為止最具有臨床意義的藥物外排系統(tǒng)。MexAB-OprM主動外排系統(tǒng)的3種蛋白 MexA、MexB、OprM是由同一操縱子所編碼，MexR及mexR-MexAB-OprM操縱元的阻遏蛋白[12]氨基酸的替換和插入都可能會影響阻遏蛋白MexR的結構，使其不能與操縱子結合，從而導致主動外排MexAB-OprM的高表達。也有文獻報道用mexR PCR產(chǎn)物測序，當126位纈氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r，發(fā)現(xiàn)不能明顯增強MexAB-OprM的表達[11]。 目前國內(nèi)關于銅綠假單胞菌多藥外排泵MexAB-OprM檢測主要是通過用RT-PCR法從內(nèi)膜蛋白結構基因mexB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平觀察MexAB-OprM主動外排系統(tǒng)的表達情況[12]。國外關于臨床株的研究較多，經(jīng)典方法主要是對外膜蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，并進一步用免疫印跡方法對外膜蛋白進行定性和半定量的研究。我們用免疫印跡方法或斑點免疫方法檢測部分臨床銅綠假單胞菌株MexAB-OprM外排泵，效果較理想。本課題曾用 MexA的 92到 106位 氨基酸 YQIDPATYEADYQSA免疫家兔，但未能獲得MexA抗體。由于國內(nèi)沒有現(xiàn)成的MexA抗體出售，而銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵中MexA/MexB和OprM蛋白都具有較好的抗原性和免疫原性，本試驗已成功構建了PUC18/mexA克隆載體，為表達MexA蛋白，并用MexA蛋白免疫家兔制作MexA抗體奠定了基礎。

[1]劉香萍,鐘 霞,向開富,等.MexAB-OprM和MexXY-OprM在耐藥銅綠假單胞菌中的表達[J].中國熱帶醫(yī)學,2007,7(5):675-676.

[2]向 莉,段 勇.銅綠假單胞菌主動外排系統(tǒng)MexAB-OprM的研究進展[J].臨床藥學,2009,15(9):1386-1387.

[3]Poole K,Krebes K,McNally C,et al.Multiple antiblotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: evidence for involvement of an efflux operon[J].JBacteriol,1993,175(22):7363-7372.

[4]Poole K,Gotoh N,Tsujimoto H,et al.Overexpression of themexC-mexD-oprJ efflux opreton in nfxB-type multidrug-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa[J].Mol Microbiol,1996,21(4):713-724.

[5]Kohler T,Michea-Hamzehpour M,Henze U,et al.Characterization of MexE-MexF-OprN,a positively regulated multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa[J].Mol Microbiol,1997,23(2):345-354.

[6]Aires JR,Kohler T,Nikaido H,et al.Involvement of an active efflux system in the natural resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(11): 2624-2628.

[7]Chuanchuen R,Narasaki C T,Schweizer H P.The MexJK efflux pump of Pseudomonas aeruginosa requires OprM for antibiotic efflux but not for efflux of triclosan[J].J Bacteriol,2002,184(18):5036-5044.

[8]Aendekerk S,Ghysels B,Comelis P,et al.Characterization of a new efflux pump,MexGHI-OpmD, from Pseudomonas aeruginosa that confers resistanceto vanadium[J].Microbiology,2002,148(Pt8):2371-2381.

[9]Li Y,Mima T,Komori Y,et al.A new member of the tripartitemultidrug efflux pumps,MexVW-OprM,in Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(4):572-575.

[10]施凱舜,潘發(fā)憤.銅綠假單胞菌耐藥研究進展[J].浙江醫(yī)學,2008, 30(2):199-202.

[11]李 良,張煥萍,王秋婷,等.銅綠假單胞菌主動外排系統(tǒng)MexABOprM與碳青霉烯類藥物耐藥的關系研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010,20(2):243-245.

[12]衣美英,黃漢菊,王鵬遠,等.多重耐藥銅綠假單胞菌MexAB-O-prM、MexXY-OprM主動外排系統(tǒng)的耐藥作用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(10):956-961.

Molecular strouin of cloning and sequencing of mexA gene from clinical pseudomonas aeruginosa

CHENG Xiaoping,SHEN Dingxia,LUO Yanping,et al.Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Nanchang University Nanchang 330006,China.

ObjectiveTo clone the 40kDa outermembrane protein gene(mexA)from clinical Pseudomonas aeruginosa for nucleotide sequencing.MethodsClinical Pseudomonas aeruginosa was cultured and then mexA temple DNA was extracted.PCR was used to amplify the mexA gene from clinical Pseudomonas aeruginosa DNA. The PCR productswere directly ligated into PUC-18 vector.The recombinat plasmid was verified by sequencing.ResultsThe clone of mexA gene was successfully constructed.The recombinat plasmid(PUC/mexA)was verified to share 99.9%homologies with that Gren Bark by sequencing.ConclusionThe cloning of mexA gene of clinical Pseudomonas aeruginosa is adapted to further expression.

Pseudomonas aeruginosa；MexA gene；Cloning；Sequence analysis

R446.5,R378.99+1,Q785

A

1674-1129(2010)03-0227-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.03.008

軍隊“十一·五”基金資助課題(06MA 294)。

程小平，1969年出生，男，碩士，主管技師，從事醫(yī)學檢驗。

*通信作者：沈定霞，1962年出生，女，博士，主任醫(yī)師，教授，從事微生物檢驗。