利用響應面法優化蝦青素發酵培養基

侯娟，王際輝，葉淑紅，王晗

（大連工業大學生物與食品學院，遼寧大連116034）

利用響應面法優化蝦青素發酵培養基

侯娟，王際輝*，葉淑紅，王晗

（大連工業大學生物與食品學院，遼寧大連116034）

以紅法夫酵母為研究對象，對其生物合成蝦青素的培養基組分進行研究。首先進行單因素試驗，確定最適培養基組分。再利用Plackett-Burman設計法考察培養基組分對蝦青素生物合成的影響，選出2個對蝦青素生物合成最為重要的營養因素：葡萄糖和復合氮源（牛肉膏∶檸檬酸三銨=1∶2，質量比）。最后通過響應面法確定紅法夫酵母產蝦青素最佳培養基組分，分別為葡萄糖3.65%，復合氮源0.45%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉0.1%，CaCl20.01%。此時蝦青素含量可達到11.81 mg/L，比優化前提高了近190%。

紅法夫酵母；蝦青素；培養基；響應面法

Abstract:The paper focused on the fermentation medium components of astaxanthin produced by Phafia rhodozyma.At first,the fermentation components of the strain were studied through single factor tests.Then the effect of the medium compositions on astaxanthin biosynthesis was investigated according to the Plackett-Burman design.The two important factors,glucose and complex nitrogen source（beef extract:ammonium citrate acid=1 ∶2，mass ratio） for astaxanthin biosynthesis were selected from all factors.At last response surface methodology was applied to optimize medium components：glucose3.65%,complex nitrogen source 0.45%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%，yeast extract 0.1%，CaCl20.01%.Then the yield of astaxanthin reached 11.81 mg/L，which increased 190%compared with that of the non-optimized condition.

Key words:Phaffia rhodozyma;astaxanthin;fermentation medium;response surface methodology

蝦青素是一種具有優良的色素沉積作用、能促進動物發育、具有超強抗氧化活性及較強抗腫瘤活性的類胡蘿卜素[1-3]。紅法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作為蝦青素生物來源的一些必要特征：蝦青素是主要的類胡蘿卜素，大約占到40%~95%，能夠利用多種糖作為碳源進行異養代謝；培養時間短；不需要光照；能夠在發酵罐中實現高密度培養[4]。因而紅法夫酵母被認為是一種最具研究價值的蝦青素大規模生產的來源。雖然利用紅法夫酵母生產蝦青素獲得了一系列的成果，但是與其他新興發酵產品相比，酵母發酵生產蝦青素具有產量低、生產成本高等問題，大規模商業化生產不普遍。因此，還應在培養基的優化，降低生產成本和提高產量等方面作深入研究。

通過培養基優化，來提高蝦青素的含量和原料的利用率，以得到適合產業化生產的高產菌株都具有重要的理論意義和應用價值[5]。以此為出發點，利用響應面法[6]，優化紅法夫酵母發酵生產蝦青素的培養基。

1 材料和方法

1.1 菌種

紅法夫酵母：大連工業大學食品生物技術實驗室保藏。

1.2 主要培養基

種子培養基：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麥芽汁0.3%。

發酵培養基：葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。

1.3 培養條件

種子搖瓶：250 mL的三角瓶裝液25 mL，從斜面上取兩環菌種在22°C，150 r/min,培養48 h。

發酵培養：250mL三角瓶裝液30mL，接種量10%，22 °C，150 r/min，培養 72 h。

1.4 測定方法

1.4.1 蝦青素的提取

二甲亞砜(DMSO)法[6]：取10 mL發酵液,離心后用去離子水洗滌離心3次，加3.5 mL 55℃的DMSO破壁，最后用15 mL丙酮提取。離心(8000 r/min，5 min)取上清液。如果提取不完全，再次破壁后加丙酮提取，直至菌體呈白色為止。并測出對應的菌體生物量。

1.4.2 蝦青素含量的測定

分光光度法[7]：在480 nm下測丙酮提取液OD值。

式中：蝦青素總量，mg/L；A為吸光度；Va為提取液的體積，mL；E為丙酮的消光系數（0.16）；Vb為發酵液的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 碳源種類對紅法夫酵母生長和蝦青素合成的影響

在無碳源發酵培養基中，分別添加20 g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙醇和可溶性淀粉，于22℃，150 r/min下發酵72 h，然后測定生物量和蝦青素產量，結果見圖1。

微生物利用碳源物質具有選擇性。從圖1可知，葡萄糖和蔗糖利于生物量和蝦青素的積累，蔗糖的生物量高于葡萄糖，但蝦青素的積累卻低于葡萄糖。以乙醇和淀粉為碳源時，蝦青素的胞內比例較高，但是由于生物量較低，造成蝦青素的產量較低。而以乳糖為碳源時，生物量和蝦青素產量均較低，菌體幾乎沒有生長。可能是由于紅法夫酵母體內缺乏乳糖分解利用的酶。從蝦青素產量角度，選用葡萄糖作為發酵的碳源。

2.2 氮源種類對紅法夫酵母生長和蝦青素合成的影響

在無氮源發酵培養基中，分別添加5 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸銨和檸檬酸三銨，于22℃，150 r/min下發酵72 h，然后測定生物量和蝦青素產量，結果如圖2。

從圖2可以看出，牛肉膏對生物量和蝦青素的積累最好，其次為酵母膏和蛋白胨，均為有機氮源。無機氮源中，檸檬酸三銨最利于蝦青素的積累。雖然最利于菌體生長和蝦青素積累的氮源是牛肉膏，但是牛肉膏的價格遠遠高于其他氮源，尤其是無機氮源。綜合考慮蝦青素的產量和生產成本，以牛肉膏和檸檬酸三銨為混合物作為發酵氮源，并通過試驗進一步確定二者的最適配比為1∶2（質量比）。

2.3 Plackett-Burman試驗設計與結果

根據上述單因素試驗結果，以及其它文獻報道，選擇發酵培養基中的葡萄糖、復合氮源、酵母抽提物、MgSO4·7H2O、KH2PO4和 CaCl2濃度 6 個因素作為考察對象，應用Plackett-Burman試驗設計法對各個因素的重要性進行研究。表頭設計及試驗列表見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman

利用MINITAB軟件進行各因素主效應分析結果見表2。

表2 各因素水平及顯著性分析效應值Table 2 Prominent analysis of factor levels and effect value

經分析檢驗得出可信度>90%的兩個因素為葡萄糖和復合氮源，其他幾個因素的可信度均<90%。因此，把酵母浸粉、硫酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈣固定在原來的水平，選擇葡萄糖和復合氮源進一步做響應面試驗。對蝦青素產量進行回歸分析所得的系數的一次擬合回歸方程為：

該方程的方差分析(ANOVA)表明,F=5.41。證明該模型在α=0.05水平顯著，失擬項P值為0.042，表明失擬不顯著。方程的相關系數R2為86.66%，調整后R2為70.65%，表明模型可以解釋70.65%的蝦青素提高水平的變化，說明方程的擬合度較好。

2.4 最陡爬坡試驗

由表2的分析結果，對葡萄糖和復合氮源進行最陡爬坡試驗，顯著因素的變化步長及方向的試驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Design and results of the most climb slope experiment

由表3可知，最佳條件處于第3組，所以選取這一組為中心點，即葡萄糖36 g/L，復合氮源4.5 g/L。

2.5 響應面分析的試驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗選擇對蝦青素有顯著影響的因子，然后采用中心組合設計對這些因素進行進一步的優化。中心組合試驗因素水平如表4，試驗設計及結果如表5。利用MINITAB軟件的多項式回歸分析對數據進行擬合得到二次多項式，它是一個描述響應值（因變量）與影響因子（自變量）關系的模型。根據回歸系數的顯著性判斷顯著影響因素，以及各因素之間是否存在交互作用。最后進行驗證試驗，分析試驗結果的可靠性，得到優化結果。

表4 中心組合試驗因素水平表Table 4 Factor levels of central composed experiment

表5 中心組合試驗設計及結果表Table 5 Design and results of central composed experiment

運用MINITAB軟件對表5的試驗設計做回歸分析得到回歸方程為:

該方程表達了蝦青素產量與所選的兩個因素之間的關系?；貧w方程的方差分析如表6，可以看出該回歸模型在α=0.05水平顯著，失擬項0.070，表明失擬不顯著，該二次方程模型能很好的解釋試驗數據的變異性。方程的相關系數R2為94.17%，調整后的R2為90.01%，表明模型可以解釋90.01%的蝦青素含量水平的變化，說明該回歸方程為培養基成分的優化提供了一個合適的模型。同時該方程的各因子與響應值之間高度顯著。回歸方程的一次項、二次項都高度顯著，而回歸方程的交互項不顯著，因此各因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

圖3為響應面等高線圖與立體圖。

從圖3中可直觀地看出各因子對象應知的影響變化趨勢，且回歸模型確實存在最大值。利用MINITAB軟件的響應優化器對響應進行優化，得到預測的響應為 11.89 mg/L，全局解為：X1=36.5，X2=4.5，即:葡萄糖加入量36.5 g/L，復合氮源為4.5 g/L時，可得到蝦青素產量為11.89 mg/L。為了驗證模型的正確性，利用上述條件做了驗證試驗，經過3次試驗取平均值得到對于1 L的發酵培養基，葡萄糖添加量為36.5 g、復合氮源為4.5 g、磷酸二氫鉀為1 g、酵母浸粉1 g、硫酸鎂0.5 g和氯化鈣0.1 g時，得到蝦青素的量為11.81 mg/L，這與理論預測值相差不大，比優化前提高了近190%。因此，利用響應面法優化得到的培養基成分參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

通過優化發酵，在蝦青素的生產過程中，碳源和氮源起主要作用。優化后的培養基為葡萄糖3.65%，復合氮源（牛肉膏：檸檬酸三銨=1∶2）0.45%，磷酸二氫鉀0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.1%，CaCl20.01%。在此培養基的基礎上進行500 mL搖瓶發酵，蝦青素的產量為11.81 mg/L，比優化前提高了190%。本試驗得到了產蝦青素紅法夫酵母液體培養基的一個非常合適的模型，同時說明響應面優化發酵條件卓有成效，為蝦青素的進一步開發利用奠定了基礎。

[1]Miki W.Biological functions and activities of animal carotenoids[J].Pure&Appl.Chem.,1991,63(1):141-146

[2]Terao J.Antioxidant activity of beta-carotene-related carotenoids in solution[J].Lipid,1989,24(7):659-661

[3]Palozza P.Astaxanthin and canthaxathin are potent antioxidants in a membrane model[J].Arch Biochem Biophys,1992,297(2):291-295

[4]梁新樂,岑沛霖.法夫酵母高密度培養及蝦青素的高產研究[J].菌物系統，2001,20(4):508-514

[5]朱曉立,裘暉,鄧毛程,等.紅發夫酵母生產蝦青素的培養基優化[J].食品與發酵工業,2008,34(2):61-64

[6]趙穎,羅璇,鐘曉凌,等.響應面法優化產類胡蘿卜素紅酵母液體發酵培養基的研究[J].化學與生物工程,2007,24(12):39-42

[7]許培雅,鄭裕國,沈寅初.分光光度法測定紅發夫酵母中蝦青素含量[J].浙江工業大學學報,2001,29(2):1006

Application of Response Surface Method in Fermentation Medium Optimization for Astaxanthin Production

HOU Juan,WANG Ji-hui*,YE Shu-hong,WANG Han
（School of Biology and Food Engineering,Dalian Polytechinic University,Dalian 116034，Liaoning,China）

2009-09-08

遼寧省創新團隊計劃（2007T009）；遼寧農業產業化計劃（2007211001；2008301029）；大連市科技計劃（2008B12NC059）

侯娟（1984—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

*通訊作者：王際輝，教授。