鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的研究

張澤生，牟浩，趙璐，趙麗，錢俊

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的研究

張澤生，牟浩，趙璐，趙麗，錢俊

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

研究鹽地堿蓬提取物的抗氧化活性。以鹽地堿蓬可食用部分的乙醇提取物作為研究對象，用體外抗氧化方法研究該提取物的抗氧化活性，并對其黃酮含量進行測定，同時對不同生長期的鹽地堿蓬的抗氧化活性進行研究。不同月份采摘的鹽地堿蓬樣品的抗氧化活性不同，抗氧化活性的強弱與其黃酮含量變化成正相關，但呈現先升后降的趨勢，黃酮含量在7月份植株顏色由綠變紅之前達到最高，且該月份提取物表現出較高的抗氧化活性。

鹽地堿蓬；抗氧化活性；黃酮

Abstract:To study the antioxidant activity of extracts from Suaeda salsa.To study the ethanol extracts of edible part of Suaeda salsa with the antioxidant mode in vitro.And compare the content of flavanols a with the antioxidant activity,then research the further activity of the most active extract in the all development months.The activity of all samples fluctuates in the same trend with the content of flavanols,and to the top in July before Suaeda salsa turning green into red,the extract of July shows the good antioxidant activity.

Key words：Suaeda salsa；antioxidative activities；flavanol

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又名翅堿蓬、黃須菜。為藜科一年生草本植物，野生于海涂或鹽場的鹽灘之上，是典型的鹽地指示植物。世界上堿蓬約有100多種，廣泛分布于亞洲、歐洲，我國有20多種，生長在我國東北、西北、華北及沿海各省的海濱、荒漠、河邊、洼地、草原、湖邊及鹽堿土地區。鹽地堿蓬營養成分豐富，無污染，被稱為標準的“綠色食品”[1]。

氧參與生命活動的同時也產生氧自由基，體內氧自由基產生過多或清除過慢與細胞的損傷和疾病的發生有著密切的聯系，如動脈粥樣硬化、肝病、糖尿病、機體衰老、癌癥等[2-3]。隨著氧自由基和抗氧化理論研究工作的深入，越來越多的國家已限制使用合成抗氧化劑。從天然物質中尋找高效、低毒的天然抗氧化劑已成為人們關心的熱點。截止2009年,從鹽生植物——堿蓬中提取抗氧化活性物質的研究報道相對較少。

鹽地堿蓬的抗氧化活性直接取決于其所含物質的種類與含量，而這與堿蓬的生長期有著密切的聯系。本研究從不同生長時期的鹽地堿蓬中提取抗氧化活性物質，并使用不同方法評價其抗氧化性，旨在為鹽地堿蓬作為天然抗氧化劑來源的可行性和保健食品的開發提供理論依據。

1 材料

1.1 原料

鹽地堿蓬：生長于天津經濟技術開發區河灘，取中上部可食用嫩葉，60℃下鼓風干燥，將烘干后的樣品粉碎成粉末，密封保藏備用。

1.2 試劑與儀器

魯米諾（98%）：美國ACROS ORGANICS出品；蘆丁：天津市科密歐化學試劑開發中心；DPPH：Fluka公司；乙醇；鹽酸；氫氧化鈉；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；碳酸氫鈉；水楊酸；30%H2O2；沒食子酸等均為國產分析純。

UVmini-1240紫外/可見分光光度計：日本島津公司；RE-3000旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；HHS11-B電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠；LGJ0.5真空冷凍干燥機：Thermo Electron Corporation；MR23i冷凍離心機：法國Jouan；KQ5200DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 鹽地堿蓬抗氧化活性成分的提取

稱取不同生長期1 g烘干粉碎后的鹽地堿蓬樣品各2份進行熱回流提取，加入65%的乙醇溶液50 mL，提取溫度為75℃，提取時間為4 h，提取2次，趁熱過濾，合并濾液，將第1份提取液置于旋轉蒸發器中減壓濃縮至原體積的1/3，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，至于4℃冰箱中冷藏，備用。將第2份提取液置于旋轉蒸發器中減壓濃縮至無有機溶劑后，凍干，備用。

2.2 黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al（NO）3方法測定[4]，以蘆丁為標準物，在510 nm波長下測定吸光值，由吸光度對濃度建立回歸方程：y=1408.6x-2.1606，相關系數：r=0.9997，式中：x為吸光值，y為黃酮濃度（μg/mL）。以該曲線作為標準曲線，測定各月份提取物中黃酮的含量。

2.3 不同生長期鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的比較

2.3.1 總抗氧化活性的評價

采用鐵還原/抗氧化能力（Ferric Reducing/AntioxidantPower，FRAP）分析法[5]。取一定量上述第1組溶液，加入3.6 mL TPTZ工作液（由0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液 25 mL，10 mmol/L TPTZ 溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成），充分混勻后，37℃水浴反應10 min，于593 nm處測定吸光度，以1.0 mmol/L FeSO4為標準樣，樣品抗氧化活性（FRAP value）以達到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數表示。

2.3.2 對DPPH自由基的清除作用[6]

取1 mL1.5×10-4mol/L DPPH甲醇溶液，加入1 mL上述第1份溶液，搖勻后室溫放置。30 min后于517 nm下測定吸光度。

樣品對DPPH自由基的清除率K=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：Ai為1 mL DPPH溶液+1 mL提取液吸光度；Aj為1 mL提取液+1 mL甲醇的吸光度；A0為1 mL DPPH溶液+1 mL甲醇的吸光度。

2.3.3 還原力的測定（普魯士蘭法）[7]

取一定量上述第1組溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和 2.5 mL 1%K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴反應20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，以5000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL雙蒸水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min后700 nm處測定吸光度，以A700nm代表還原力強度，A越大，代表還原力越大。

2.4 鹽地堿蓬7月份提取物抗氧化活性的評價

將冷凍干燥后的7月份樣品粉末配制成不同濃度的水溶液，待用。

2.4.1 清除超氧陰離子

2.4.1.1 紫外分光光度法[8-9]

采用鄰苯三酚自氧化法。

測定步驟：取4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，在25℃水浴中預熱20 min，加入1 mL供試液和0.5 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚，混勻后在25℃水浴中準確反應5 min，立即用0.1 mL 8 mol/L HCl終止反應，并在波長320 nm處測定吸光度（A）值，對照組用0.5 mL蒸餾水代替鄰苯三酚，以抗壞血酸為陽性對照，同時設立試劑空白管。

清除率S=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：A0為空白對照；Ai為提取液的吸光值；Aj為無鄰苯三酚時提取液的吸光值。

2.4.1.2 化學發光法[10]

測定樣品對堿性鄰苯三酚體系（非酶體系）產生O2-·的清除作用。具體方法是：在反應池中依次加入0.5 μL 0.2 mmol/L的魯米諾溶液（用 pH=10.16，0.1 mol/L的 Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制）、50 μL不同濃度的供試液，混勻后迅速置于發光儀檢測器中，用0.1 mL 6 mmol/L的鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L的HCl配制）啟動反應，測定6 s內發光強度CP0，以抗壞血酸為陽性對照，水做空白對照，測其CP1，按下式計算樣品液的清除率：清除率=（CP0-CP1）/CP0×100%。

2.4.2 清除羥自由基

2.4.2.1 紫外分光光度法[11]

在試管中依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，一定量的供試液，2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，靜置30 min后以5000 r/min離心10 min，于510 nm處測其吸光值，以抗壞血酸為陽性對照。清除率S=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：A0為空白對照；Ai為提取液的吸光值；Aj為無水楊酸時提取液的吸光值。

2.4.2.2 化學發光法[12]

用魯米諾化學發光法測定樣品對Fenton型反應產生的·OH的清除作用。具體方法是：向反應池中依次加入 40 μL 2 mmol/L 的抗壞血酸、70 μL 2 mmol/L的 CuSO4溶液、15 μL 10 mmol/L 的魯米諾溶液、50 μL 0.2 mol/L pH=7.8的磷酸緩沖液、20 μL不同濃度的供試液，混勻后，迅速置于發光儀檢測器中，80 μL過氧化氫啟動反應，同時記錄第6秒時發光強度出現的峰值CP0，以抗壞血酸為陽性對照，水做空白對照，測其CP1，羥自由基的清除率=（CP0-CP1）/CP0×100%。

2.4.3 清除過氧化氫[13-14]

采用H2O2-魯米諾-碳酸緩沖液（pH 9.5）體系檢測H2O2：在反應池中依次加入50 μL不同濃度的供試液、50 μL 10 mmol/L的魯米諾溶液（用 pH=9.5，0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制）、100 μL碳酸緩沖液，50 μL 0.15%過氧化氫啟動反應，連續測定反應強度6 s，至出現峰值，記錄發光強度（CL），以抗壞血酸為陽性對照，發光抑制率按下式計算：清除率=1-樣品CL/對照CL×100%（為防止玻璃儀器沾染有機物，抗氧化試驗中所有玻璃儀器均采用以下步驟處理：a.用洗液浸泡；b.自來水沖洗；c.發煙硝酸浸泡 1 h 以上；d.蒸餾水煮沸；f.蒸餾水漂洗用3次后使用）。

3 結果與分析

3.1 鹽地堿蓬生長期提取物黃酮含量

以蘆丁為標準物，在510 nm波長下紫外分光光度法測定吸光值的結果見圖1。

從圖1可以看出，在1年的生長中，不同月份的鹽地堿蓬乙醇提取物中總黃酮含量存在差異，在由綠變紅之前的7月達到最大值，其含量約是其它各月含量的3倍～5倍（以干基表示）。

3.2 鹽地堿蓬生長期各月份提取物抗氧化活性的比較

3.2.1 總抗氧化活性的評價

在黃酮含量不同的條件下，不同生長月份的鹽地堿蓬抗氧化能力見表1。

表1 不同生長期鹽地堿蓬的總黃酮含量及FRAP值Table 1 The flavanols content and FRAP value of Suaeda salsa in different stage

從表1可知，不同生長月份的鹽地堿蓬的抗氧化活性存在差異，其中7月份的樣品FRAP值最大，抗氧化活性最強，隨著提取物黃酮含量的增加，其總抗氧化活性也增大。

3.2.2 對DPPH自由基的清除作用

不同月份鹽地堿蓬的提取物對DPPH自由基的清除作用見圖2。

從圖2可看出，不同月份鹽地堿蓬的提取物對DPPH自由基的清除作用存在差異，且變化趨勢與其黃酮含量變化趨勢一致。7月份提取物對該自由基的清除率已接近70%，說明鹽地堿蓬提取物具有較高的DPPH自由基清除能力。

3.2.3 還原力的測定

不同月份鹽地堿蓬的提取物對DPPH自由基的清除作用見圖3。均有較強的清除能力，并呈現明顯的劑量效應，即濃度越大，抗氧化效果越好。

3.3.1.2 化學發光法

不同濃度的2種樣品加入到O2-·體系后，使用化學發光檢測對O2-·的清除能力見圖5。

從圖3可以看出，不同月份鹽地堿蓬的乙醇提取物的還原力強度與其清除DPPH自由基變化趨勢的一致性，且7月份提取物的還原力達到了最大值。

通過以上抗氧化模型可以看出，鹽地堿蓬提取物的抗氧化活性變化與其黃酮類物質的含量變化相一致，說明在該提取物的抗氧化活性成分中，黃酮類物質起主要作用，并且7月份提取物中黃酮量最高，抗氧化活性也最強。

3.3 鹽地堿蓬生長期7月份提取物抗氧化活性評價3.3.1 清除超氧陰離子

3.3.1.1 紫外分光光度法

不同濃度的2種樣品加入到O2-·體系后，使用紫外分光光度法對O2-·的清除能力見圖4。

2種樣品對O2-·的清除效果均隨其濃度的增大而增大，在低濃度時，7月份提取物的清除效果高于抗壞血酸。

3.3.2 清除羥自由基

3.3.2.1 紫外分光光度法

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，使用紫外分光光度法羥基清除效果見圖6。

由圖4可知，在試驗濃度范圍內2種樣品對O2-·

從圖6中可看出，7月份提取物對·OH有一定的清除能力，且清除作用隨樣品濃度的增大而增大。在試驗濃度范圍內，抗壞血酸的清除能力始終大于7月份提取物。

3.3.2.2 化學發光法

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，使用化學發光法檢測羥基清除效果見圖7。

圖7顯示，7月份提取物對·OH有較強的清除能力，且劑量效應明顯，樣品濃度在1 mg/mL時，清除率走平，且清除能力高于抗壞血酸。

3.3.3 清除過氧化氫

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，過氧化氫清除效果見圖8。

由圖8可知，7月份提取物對H2O2有較強的清除能力，且清除率隨樣品濃度的增大而增大，當濃度為1 mg/mL時，清除率達90%以上。在所選濃度范圍內，7月份提取物對H2O2的清除效果與抗壞血酸相當。

4 結論

本文研究表明，鹽地堿蓬的抗氧化活性與其含有的黃酮類物質有著密切的關系，在其1年生長期中，7月份黃酮含量最高，為每克干基98.78 mg/g，在各體外抗氧化模型中，其提取物具有較強的自由基清除能力和抗氧化活性，因此鹽地堿蓬可作為功能性食品的開發。

[1]谷奉天.開發鹽地堿蓬綠色系列食品研究[J].濱州教育學院報,1999,5(3)：43-48

[2]嚴建剛，張名位，楊公明，等.芹菜提取物清除自由基作用研究[J].食品科學，2004(8)；39-42

[3]高蔭榆，洪雪娥，羅麗萍，等.甘薯葉柄藤類黃酮的體外抗氧化作用研究[J].食品科學，2006(7)；103-106

[4]趙玉平，肖春玲.苦養麥不同器官總黃酮含量測定及分析[J].食品科學，2004(10)：264-266

[5]Manuela Blasa,Manila Candiracci,Augusto Accorsi,et al.Raw Millefiori honey is packed full of antioxidants[J].Food Chemistry,2006,97：217-222

[6]張燕平，戴志遠，陳肖毅.紫蘇提取物體外清除自由基能力的研究[J].研究與探討,2003,24(10)：67-70

[7]劉杰超,王思新,焦中高,等.蘋果多酚提取物抗氧化活性的體外試驗[J].果樹學報,2005,22(2)：106-110

[8]Nicholas Smimoff,Quinton J Cumbes.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry,1989,28(4)：1057-1060

[9]孟慶國.薤白水提物對羥自由基的清除作用[J].濰坊醫學院學報,1998,20(1)：33-34

[10]王曉,張紅俠,鄧煜光，等.加楊雄花序提取物體外抗氧化及對DNA損傷的保護作用研究[J].食品科學,2005,26(4)：216-219

[11]張東，文松林，高俊杰，等.雞冠花紅褪色光度法測定羥自由基[J].沈陽理工大學學報,2006，25(3)：12-14

[12]丁利君,周國棟.蓮子水溶性糖的提取及其對自由基清除能力的研究[J].食品科學,2002,23(8)：252-254

[13]王威.常用天然色素抗氧化活性的研究[J].食品科學,2003,24(6)：96-99

[14]博路,杭瑚.核桃殼抗氧化和清除活性氧自由基的研究[J].食品工業科技,2002,23(3)：15-16

Study on Antioxidant Activity of Suaeda Salsa Extract

ZHANG Zen-sheng,MU Hao,ZHAO LU,ZHAO Li,QIAN Jun
（College of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin 300457,China）

2010-05-29

國家科技支撐計劃項目（編號2006BAD27B06）

張澤生（1956—），男，教授，博士生導師，研究方向：功能食品及配料的研究與開發，天然產物的生物活性及機理研究。