苜蓿葉蛋白提取工藝參數優化試驗

肖海峻，孟利前，楊新建，田錦，雷莉輝，曹允

（北京農業職業學院食品與生物工程系，北京102442）

苜蓿葉蛋白提取工藝參數優化試驗

肖海峻，孟利前，楊新建，田錦，雷莉輝，曹允

（北京農業職業學院食品與生物工程系，北京102442）

以水為溶劑，采用熱凝絮法分別研究水浴溫度、水浴時間、苜蓿切碎長度、料液比、打漿時間、離心轉速和離心時間對葉蛋白提取效果的影響；在單因素試驗的基礎上，采用7因素2水平正交試驗對苜蓿葉蛋白提取工藝進行優化，試驗結果表明，打漿時間、水浴時間、打漿的料液比、苜蓿切碎長度、水浴溫度是影響苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率的主要因素。其最佳提取工藝參數是：打漿時間5 min，水浴時間為12 min，打漿時料液比為1∶5，苜蓿切長為1 cm，水浴溫度為80℃，離心時間10 min，離心轉速為3000 r/min。該研究旨在探索苜蓿葉蛋白提取工藝參數優化試驗，為大規模生產苜蓿葉蛋白提供參考。

苜蓿；提取工藝；葉蛋白

Abstract:Using water as extracting solvent,the extraction effects of water temperature and heating time,alfalfa mincing length,the radio of water to alfalfa,pulping time,centrifugal rev and time were studied respectively；based on the single factor experiment,the orthogonal experiment 7 factors and 2 levels were used to research the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa，the results showed that main factors which had an effect on the extracting rate and the contents of of leaf protein were pulping time,heating time,the radio of water to alfalfa,alfalfa mincing length and water temperature.Based on the analysis of above,the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa as follows：pulping time of 5 minutes,heating time of 12 minutes,the radio of water to alfalfa of 5,alfalfa mincing length of 1cm,water temperature of 80℃,centrifugal rev and time was 10 min and 3000 r/min.The aim of this paper was to provide an basis for mass production of leaf protein.

Key words：alfalfa；extraction processing；leaf protein

葉蛋白泛指以新鮮的青嫩莖葉為原料，經榨汁、絮凝、濃縮、干燥等工藝提取的一種富含蛋白質的濃縮物（leaf protein concentration 簡稱 LPC）[1]，由細胞質蛋白、葉綠體內的基質蛋白及部分線粒體蛋白組成的混合物[2]。

苜蓿葉蛋白具有產量高、凝聚顆粒大、易分離、品質好等特點，因而苜蓿是目前用于生產LPC的主要原料。苜蓿葉蛋白具有極高的營養價值，其氨基酸種類齊全而且組成比例較為平衡[3]，與聯合國糧農組織推薦的成人氨基酸模式基本相符,可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑；苜蓿還具有極高的飼用價值，用苜蓿葉蛋白取代豬、家禽日糧中的部分乃至全部蛋白質飼料或取代哺乳犢牛的部分全乳代用品時,都能取得良好的飼養效果[4]；此外，苜蓿還具有抗衰老、抗腫瘤、治療關節炎、心血管病、肺氣腫、老年性白內障等功效。葉蛋白提取之后的殘渣可直接作為飼料喂養家畜。由此可見，從苜蓿中提取葉蛋白不僅可以緩減當前蛋白飼料資源短缺的局面，也是牧草深加工和綜合利用的有效途徑[5]。

近年來，對葉蛋白提取工藝參數的研究主要集中在料液比、汁液的pH、保溫的溫度及時間等方面[6-8]。在此基礎上又增加苜蓿切碎長度、離心轉速、離心時間及水浴時間等參數進行研究，考察蛋白質提取工藝參數對葉蛋白得率及蛋白質提取率的影響，以獲得葉蛋白提取最佳工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿，2008年5月種植于北京市大興區榆垡鎮，2009年6月份采集，清洗后于-5℃冷凍儲藏，測定其含水量為69%，粗蛋白含量為22.3%。

1.2 儀器

FA-2004N電子分析天平、pHS-3C酸度計：上海精密科學儀器有限公司；A-88組織搗碎勻漿機：金壇市醫療儀器廠；LD4-2低速離心機：北京醫用離心機廠；SM-3X恒溫干燥箱：上海神模電氣有限公司；8002型恒溫水浴鍋：北京光明醫療機械廠。

1.3 方法

1.3.1 葉蛋白提取工藝

準確稱取一定數量的苜蓿，將其切碎并按一定比例加水，用打漿機打漿，用2層紗布過濾，將得到的濾液在設置溫度下加熱凝絮，經離心得到沉淀物葉蛋白，在烘箱65℃條件下烘干得到葉蛋白提取物，稱其質量，具體的工藝流程如圖1。

圖1 葉蛋白提取工藝流程圖Fig.1 Technical process of extraction leaf protein from alfalfa

1.3.2 葉蛋白提取工藝考核指標

以葉蛋白得率及蛋白質提取率2個指標對葉蛋白提取工藝條件進行研究，其計算公式[2]分別是：

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗

1.4.1.1 水浴溫度對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴時間10 min，苜蓿切長為2 cm，打漿時料液比為 1∶6（g/mL），打漿時間為 5 min，離心轉速為3000 r/min,離心時間為10 min，水浴溫度分別為60、70、80、90、100℃時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.2 水浴時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長為2 cm，打漿時料液比為 1∶6（g/mL），打漿時間為 5 min，離心轉速為3000 r/min,離心時間為10 min，水浴時間分別為4、6、8、10、12 min時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.3 苜蓿切碎長度對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為 80 ℃，打漿時料液比為 1∶6（g/mL），打漿時間為5 min，離心轉速為3000 r/min,離心時間為10 min，苜蓿切長分別為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 cm 時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.4 打漿時料液比對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長為2 cm，打漿時間為5 min，離心轉速為3000 r/min,離心時間為10 min，水浴時間為 10 min，料液比分別是 1∶5、1∶6、1∶7 和1∶8（g/mL）時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.5 打漿時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長為2 cm，離心轉速為3000 r/min,離心時間為10 min，水浴時間為10 min，料液比為 1∶6（g/mL），打漿時間分別為 3、5、7 min 時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.6 離心轉速對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長為2 cm，離心時間為10 min，水浴時間為 10 min，料液比為 1∶6（g/mL），離心轉速分別為2000、3000、4000 r/min時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.1.7 離心時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長為2 cm，水浴時間為10 min，料液比為 1∶6（g/mL），離心轉速為 3000 r/min,離心時間分別為5、10、15、20 min時測定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質提取率。

1.4.2 正交試驗

在單因素試驗研究的基礎上，選用水浴溫度、水浴時間、苜蓿切碎長度、料液比、打漿時間、離心轉速、離心時間7個參數進行L8(27)正交試驗，具體的正交試驗方案見表1；在該試驗中分別選用葉蛋白得率及蛋白質提取率對葉蛋白提取工藝條件進行分析，每一水平重復3次。

表1 葉蛋白提取試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of extraction experiments of LPC

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 水浴溫度對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響水浴溫度對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響見圖2。

從試驗結果（見圖2）可以看出，隨著溫度的升高，葉蛋白得率及蛋白質提取率在增加，當水浴溫度為80℃時，葉蛋白得率及蛋白質提取率均達到最大，此時再增加溫度，提取率的變幅不大，因此確定該試驗中水浴溫度為80℃。

2.1.2 水浴時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響水浴時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響見圖3。

從圖3可以看出，隨著水浴時間的延長，葉蛋白得率的量在增加，當水浴時間超過10 min后，葉蛋白得率的量在減少，而蛋白質提取率隨著水浴時間的延長在不斷增加，但超過10 min變幅不大，從降低成本的角度考慮，水浴時間應該選10 min。

2.1.3 苜蓿切碎長度對葉蛋白得率的影響

苜蓿切碎長度對葉蛋白得率的影響見圖4。

從圖4可以看出，當苜蓿切碎長度從0.5 cm逐漸加長時，葉蛋白得率及蛋白質提取率隨著增加，當切碎長度超過2 cm時，葉蛋白得率和蛋白質提取率下降。隨著切碎長度的增加，苜蓿在打漿過程中的破碎程度逐漸降低，導致蛋白質不能全部溶解出來，最終導致提取率降低。

2.1.4 打漿時料液比對葉蛋白得率的影響

打漿時料液比對葉蛋白得率的影響見圖5。

從圖5可以看出，葉蛋白得率及蛋白質提取率隨著料液比的增加而減少，在料液比為1∶5（g/mL）到1∶7（g/mL）之間變幅較小，從成本的角度考慮，料液比應該選定為 1∶5（g/mL）更適宜。

2.1.5 打漿時間對葉蛋白得率的影響

打漿時間對葉蛋白得率的影響見圖6。

從圖6可以看出，打漿時間為5 min時，葉蛋白得率及蛋白質提取率均獲得最大值，在5 min以前，由于打漿時間短，細胞沒有充分破碎，因此獲得的蛋白質量很少，當打漿時間超過5 min時，也可能由于打漿時間的延長，對蛋白質結構的破壞也隨著增加，因此也會造成蛋白質數量減少。

2.1.6 離心轉速對葉蛋白得率的影響

離心轉速對葉蛋白得率的影響見圖7。

從圖7可以看出，葉蛋白得率和蛋白質提取率隨著轉速的增加而增加，當離心轉速達到4000 r/min時，這2個指標達到最大，因此在提取過程中可以選擇4000 r/min。

2.1.7 離心時間對葉蛋白得率的影響

離心時間對葉蛋白得率的影響見圖8。

從圖8可以看出，離心時間從5 min增加到10 min時，葉蛋白得率及蛋白質提取率變化較大，超過10 min時，兩者的增幅變化不大，因此可確定離心時間為10min。

2.2 正交試驗

2.2.1 以葉蛋白得率為指標對葉蛋白提取工藝進行分析

正交試驗方案及結果分析和方差分析結果見表2、表3。

表2 試驗方案及結果分析Table 2 Experiment project and analysis results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

從表3可以看出，因素主次順序為：E-B-D-C-AG-F，對因素 E、B、D、C、A、G 和 F 進行分析，確定優水平為E2B2D1C2A1G1F2，即打漿時間為5 min，水浴時間為12 min，打漿時料液比為1∶5 g/mL，苜蓿切長為1 cm，水浴溫度為80℃，離心時間10 min，離心轉速為3000 r/min為最優方案。

2.2.2 以蛋白質提取率為指標對葉蛋白提取工藝進行分析

正交試驗結果分析和方差分析結果見表4、表5。

表4 試驗方案及結果分析Table 4 Experiment project and analysis results

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance

由表5可以看出，因素主次順序為：E-B-D-A-CF-G，由表 2對因素 E、B、D、A、C、F 和 G 進行分析，確定優水平為E2B2D1A1C2F2G1，即打漿時間為5 min，水浴時間為12 min，水浴溫度為80℃，打漿時料液比為1∶5（g/mL），苜蓿切長為 1 cm，離心轉速為 3000 r/min,離心時間為10 min為最優方案。

在所選的7個參數中，打漿時間對葉蛋白得率和蛋白質提取率的影響最大，這充分表明了細胞的破碎程度是影響著蛋白質提取的重要因素，因此在提取蛋白的過程中，一定要把細胞充分破碎，是獲得高提取率的前提，打漿時間的長短會影響其破碎程度。

其次為水浴時間和料液比，這也是影響蛋白提取率的2個因素。隨著水浴時間的延長，葉蛋白得率及蛋白質提取率在不斷增加，但也要注意不能水浴時間太長，否則會提升成本；隨著料液比增加時，葉蛋白得率及蛋白質提取率在降低，當料液比很低時會導致浸提不充分，從而影響提取效果，但當料液比很高時，造成濃度很稀，蛋白質凝集性差，也會造成蛋白質提取效果不好的局面。

再次，對葉蛋白提取效率影響最小的2個因素是離心時間和離心轉速，這可能與苜蓿葉蛋白凝聚顆粒大、易分離等特點有關，因此，為降低成本，可選用較低的轉速和較短的離心時間。

3 結論

從以上分析可以看出，采用葉蛋白得率及蛋白質提取率這2個指標對葉蛋白提取最佳工藝條件進行分析的結果較為一致，因此確定打漿時間為5 min，水浴時間為12 min，水浴溫度為80℃，打漿時料液比為1∶5（g/mL），苜蓿切長為 1 cm，離心轉速為 3000 r/min，離心時間為10 min為苜蓿葉蛋白最佳提取工藝條件。

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[8]田少君，張磊.煙葉葉蛋白的提取研究[J].食品科技，2005(5)：15-17

Experimental Study on Parameter Optimization of Extraction Process of Leaf Protein from Alfalfa

XIAO Hai-jun,MENG Li-qian,YANG Xin-jian,TIAN Jin，LEI Li-hui,CAO Yun
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442,China）

2010-06-20

北京市教委科技計劃面上項目（KM200900005007）-苜蓿葉蛋白提取技術研究

肖海峻（1966—），女（漢），副教授，博士，研究方向：植物種質資源的開發與利用。