夏枯草多糖的清除自由基及抗氧化活性

熊雙麗，李安林

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

夏枯草多糖的清除自由基及抗氧化活性

熊雙麗，李安林

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

以夏枯草多糖提取率為考察指標，用正交設計試驗確定夏枯草多糖的最佳提取工藝，并測定多糖的自由基清除活性和脂質過氧化抑制活性。結果發現：影響多糖提取率最主要的因素是料液比，其次是提取溫度和時間。最優工藝條件為提取溫度90℃，時間4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率達5.39%。夏枯草多糖對羥自由基和DPPH自由基的清除作用，以及卵磷脂脂質過氧化損傷抑制作用較強，在濃度為0.8 mg/mL時，羥基自由基清除率達96.25%，濃度為0.5 mg/mL，DPPH自由基清除率達68.81%。前兩者的清除能力隨著夏枯草多糖濃度升高而增強，并呈明顯的量效關系，但當濃度超過一定值時，結果卻相反。而多糖對卵磷脂脂質過氧化損傷的抑制作用一直呈正相關。

夏枯草；多糖；自由基

Abstract:This article mainly adopted orthogonal design experiment to optimize extracting technology of polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn by using extraction rate as objective index,also determined the property of free radcial such as hydroxyl free radical and DPPH free radical and lipid peroxidation-inhibiting effect.The results exhibited that solid-liquid ratio is most important factor for the extraction percentage of the polysaccharides,the time and temperature are the second.The optimal extraction technology conditions are：temperature 90 ℃,extraction time 4 h,solid-liquid ratio 1∶35.The yield of the polysaccharides is 5.39%.The polysaccharide has good capability to scavenge the hydroxyl free radical and DPPH free radical,and the scavenging capability is obviously related to the concentrations.However,the results are contrary when concentration is excessive.The hydroxyl free radical-scavenging rate is 96.25%at the concentration of 0.8 mg/mL,while the DPPH free radical-scavenging rate is 68.81%at the concentration of 0.5 mg/mL.Polysaccharide also inhibits lipid peroxidation of lecithinum,which is also dependent on its concentration.

Key words：Prunella vulgaris Linn；polysaccharide；free radical

自由基醫學研究表明，當機體的氧化與抗氧化處于一種動態平衡時，自由基是機體內不可缺少的活性物質，作為第二信使參與細胞信號轉導[1]。而在患病或衰老等狀態下，自由基水平明顯升高，從而導致或加重許多疾病的發生，如動脈粥樣硬化、肝病、糖尿病、癌癥、老年癡呆癥[2-3]。目前由于一些合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚被發現有不同程度的致癌等毒副作用，因而在美國和日本已停止使用。目前，天然植物抗氧化劑日益成為研究的熱點，廣泛應用于食品、醫藥保健品和化妝品等行業[4-5]。夏枯草（Prunella vulga ris Linn）為唇形科植物,全球約15種，在我國主產于湖南、安徽、浙江、江蘇。其主要成分含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、揮發油及糖類等[6]。目前報道得較多的是夏枯草小分子化合物的分離和生物活性，以及多糖的抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[7]。而對該多糖的工藝和自由基清除，以及抗氧化活性鮮見報道。本文主要優化夏枯草多糖的提取工藝，測定該多糖的羥基自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和脂質過氧化抑制活性，為夏枯草新型功能食品的開發和進一步的綜合利用提供理論參考。

1 材料與儀器

原料：夏枯草：成都藥店。

主要試劑：DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基；2,2-diphenyl-1-picry-hydrazyl radical）；卵磷脂：Sigma公司，硫代巴比妥酸、水楊酸、三氯乙酸等皆為分析純。

主要儀器：TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析有限責任公司；旋轉蒸發器RE-52：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；MODULYOD冷凍真空干燥機：美國Thermo Electron公司；DZF-6020真空干燥箱：上海一恒儀器廠。

2 方法

2.1 夏枯草多糖提取工藝優化

2.1.1 夏枯草的預處理

稱取一定量夏枯草粉末，用乙醇回流處理4 h，回流2次，以去掉部分醇溶性雜質如黃酮、色素、低聚糖等物質。再將回流后的殘渣晾干后進行多糖提取。

2.1.2 正交試驗設計

以往研究發現提取溫度、時間、料液比對夏枯草多糖提取率影響較大。本文主要以提取液中多糖提取率為指標，采用三因素三水平以優化多糖的最佳提取工藝，正交設計方案如表1。

表1 因素水平設計表Table 1 The factors and levels of orthogonal design experiment

2.1.3 夏枯草多糖含量測定

總糖測定：采用硫酸-苯酚法（以葡萄糖為標準品）[8]。

還原糖測定：3,5-二硝基水楊酸測測定法[8]。

2.1.4 夏枯草多糖提取工藝

夏枯草全草粉→60℃烘干→粉碎過篩（40目）→乙醇去醇溶性物質2次→90℃攪拌提取4 h→50℃真空減壓濃縮→大孔非極性吸附樹脂HZ-820脫色→乙醇沉淀→50℃真空烘干→粗多糖M，以測定其自由基清除活性和抗氧化活性。

2.2 夏枯草多糖羥基自由基清除活性[9]

羥基自由基體系中加入水楊酸，生成有色物質2,3-二羥基苯甲酸，在此體系中加入具有清除羥基自由基（·OH）的被測物，從而使有色產物生成量減少，采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系中8.8 mmol/L H2O2、6 mmol/L Fe2+和 6 mmol/L 水楊酸乙醇溶液）中加入一系列不同質量分數的夏枯草多糖溶液，并用去離子水作為參比，與試劑空白液比較，在510 nm處測量各質量分數下的吸光值，按下式計算夏枯草多糖的羥基自由基清除率：

式中：R為被測液對·OH的清除率；Ai為加試樣和水楊酸溶液體系反應后溶液吸光度；Aj為不加水楊酸體系，只加試樣的溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加水楊酸體系的吸光值。

2.3 夏枯草多糖DPPH自由基清除活性[10]

DPPH自由基是一種穩定的以氮為中心的質子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm處有強烈吸收，在有自由基清除劑存在時，自由基清除劑提供一個電子與DPPH的孤對電子配對，而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關系，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線形關系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強，吸光度越小。按下式計算夏枯草多糖對DPPH自由基的清除率：

式中：K為被測液對DPPH自由基的清除率；Ai為加試樣反應后DPPH溶液吸光度；Aj為不加DPPH，只加試樣的溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加DPPH的溶液的吸光度。

2.4 抑制脂質體過氧化能力[11-12]

2.4.1 試劑的配制

脂質體PBS分散系（LLS）：300 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲波處理30 min，冰浴保存；三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸（TCA-TBA-HCl） 混合液∶15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL濃鹽酸依序溶于100 mL水中。

2.4.2 抑制脂質體過氧化能力的測定

于樣品管中依次加入1 mL LLS、1 mL 400 μmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL樣品，混勻，避光，于37℃水浴中保持60min，再加入2mLTCA-TBA-HCl混合液，100℃水浴中反應15 min，冰水中迅速冷卻，以4000 r/min轉速離心10 min，取上清液在535 nm測定吸光值As。空白管以1 mL去離子水代替1 mL樣品，操作方法同樣品管,可測得空白管的吸光度Ac。根據下列公式計算抑制率 S=[(Ac-As)/Ac]×100%。

3 結果與分析

3.1 夏枯草多糖提取的工藝條件

夏枯草多糖提取的工藝條件見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 The orthogonal design experiment and results of polysaccharide extraction

從表2可以看出，時間、溫度和料液比對總糖和多糖提取率影響較大，而對還原糖提取率幾乎無影響，說明夏枯草多糖耐熱性好，受提取溫度和時間影響小。正交試驗及極差分析結果表明各因素對夏枯草多糖提取率影響的順序為：料液比＞溫度＞時間。最優水平組合為溫度90℃,提取時間4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率5.39%。

3.2 夏枯草多糖對羥基自由基的清除活性

夏枯草多糖對羥基自由基的清除活性見圖1。

在生命活動的氧化代謝過程中不斷產生各種自由基，·OH和超氧陰離子自由基具有廣泛代表性，后者形成最早，前者的反應活性最強，對機體危害最大[13]，因為·OH是僅次于F-的強氧化劑，幾乎可以和所有的細胞組分(核酸、蛋白質和脂質等)發生反應，對于篩選、評價具有清除自由基能力的生化藥品和功能食品有著重要意義。圖1顯示，夏枯草多糖具有較強的自由基清除活性，在多糖濃度為0.8 mg/mL時，清除率達96.25%。在一定的濃度范圍內，夏枯草多糖的羥基自由基清除活性隨濃度的增加而增強，當多糖濃度超過0.9 mg/mL時，效果卻相反。該多糖·OH清除活性高于一般其它植物多糖，而且濃度過高，效果卻越差，這也與其它植物多糖不同[14]，有待進一步研究。

3.3 夏枯草多糖對DPPH自由基的清除活性

夏枯草多糖對DPPH自由基的清除活性見圖2。

DPPH自由基是一種穩定的非水溶性化學自由基，常用來評價活性物質對自由基的清除能力[15]。圖2顯示，不同濃度夏枯草多糖對DPPH自由基清除活性隨時間的延長而增強，當時間超過35 min時，自由基清除率幾乎不再增加。DPPH自由基清除率也是隨濃度的增加而增加，當超過0.7 mg/mL時，清除率降低，與羥基自由基清除效果一致。當濃度為0.5 mg/mL，在35 min時，DPPH自由基清除率最高，達68.81%。

3.4 夏枯草多糖抑制脂質過氧化作用

夏枯草多糖抑制脂質過氧化作用見圖3。

選擇常用的由Fe2+引發的卵磷脂磷酸緩沖液分散系，通過檢測卵磷脂的氧化產物——過氧化物經分解產生的二級產物丙二醛來衡量脂質體的氧化程度。在酸性條件下，卵磷脂可被·OH氧化損傷產生丙二醛（MDA）類似物，硫代巴比妥酸（TBA）可與MDA類似物反應生成粉紅色物質，該物質在532 nm處有最大光吸收，加入夏枯草多糖后，可有效抑制MDA的生成，進而反映夏枯草多糖的抗脂質過氧化作用。圖3顯示，在所測定的濃度范圍內，夏枯草多糖對由Fe2+引發的卵磷脂分散系過氧化的抑制能力均隨其濃度的增大而增大，在其加入量較小(濃度較低)時，加入量與清除率表現出量效關系，當濃度增大到一定值時，清除率隨濃度的增加而呈微小變化。

4 結論

經正交設計試驗優化，用水提醇析法提取夏枯草多糖的最佳工藝條件為：提取溫度90℃，料液比1∶35（g/mL），提取時間 4 h，多糖提取率可達 5.39%。夏枯草多糖對羥自由基·OH和·DPPH的清除作用較強，前者在濃度為0.8 mg/mL時，清除率達96.25%，后者濃度為0.5 mg/mL，達68.81%。兩者的清除能力隨著夏枯草多糖濃度增加而升高，并呈明顯的量效關系，但當濃度超過一定值時，結果卻相反。夏枯草多糖對卵磷脂脂質過氧化損傷有顯著抑制作用，也呈現明顯的量效關系。為夏枯草作為天然抗氧化劑的應用奠定了理論基礎，而夏枯草多糖中主要表現抗氧化活性的具體級分和構效關系有待進一步研究。

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Free Radical-Scavenging and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn

XIONG Shuang-li,LI An-lin
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-20

西南科技大學國防重點學科實驗室重點培育項目(07JGZB18)

熊雙麗（1977—），女（漢），副教授，博士，研究方向：碳水化合物與生物技術。