液體乳中抗生素殘留量快速檢測(cè)方法探究

俞漪，胡雪蓮，巢強(qiáng)國(guó)，熊薇

（上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233）

液體乳中抗生素殘留量快速檢測(cè)方法探究

俞漪，胡雪蓮，巢強(qiáng)國(guó)，熊薇

（上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233）

抗生素在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，不可避免地造成牛奶中殘留抗生素。抗生素殘留不僅危害人類健康，同時(shí)也影響牛奶的品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)檢測(cè)生鮮乳中抗生素殘留量方法眾多。對(duì)3種快速檢測(cè)方法（SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法、嗜熱鏈球菌抑制法（TTC）和ECLIPSE50試劑盒微生物抑制法）進(jìn)行了比較，以尋求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的方法，以滿足日趨嚴(yán)格的殘留限量要求，保障人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全。

抗生素殘留量；SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法；嗜熱鏈球菌抑制法（TTC）；ECLIPSE50試劑盒微生物抑制法

Abstract:Extensive use of antibiotics in animal husbandry,will inevitably result in antibiotic residues in milk.Antibiotic residues are not only harmful to human health,but also affect the quality of milk,resulting in economic losses.Health is now testing antibiotic residues in milk many methods.In this paper,three kinds of rapid detection methods(SNAP pairs of the flow of enzyme-linked immunosorbent assay,inhibition of Streptococcus thermophilus(TTC)and ECLIPSE50 Kit microbial inhibition method)were compared in order to seek simple,rapid,accurate and sensitive method of high in order to meet the increasingly stringent requirements residue limits to protect people's health and safety of drinking milk.

Key words:antibiotic residues;SNAP double-flow enzyme-linked immunosorbent assay;inhibition of Streptococcus thermophilus(TTC);ECLIPSE50 microbial inhibition assay kit

抗生素主要指由微生物產(chǎn)生的、能抑制或殺死其他微生物的一類化學(xué)物質(zhì)。在乳品業(yè)中常用β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素用作畜類乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病的治療；也有一些生產(chǎn)者在飼料中添加抗生素，以改善畜禽的新陳代謝，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高畜禽成活率和飼料轉(zhuǎn)化率[1]。食品和藥品管理局（FDA）的調(diào)查表明：不注意休藥期、用藥不合理或是使用違禁藥物，是導(dǎo)致乳品中抗生素殘留的主要原因。長(zhǎng)期攝入含抗生素的乳品，可造成藥物積累，當(dāng)其達(dá)到一定濃度后，就會(huì)對(duì)人體的健康帶來一系列的負(fù)面影響[2]。近年來，隨著食品安全問題的日益受到人們的關(guān)注，乳品中的抗生素殘留監(jiān)控也越來越受到各生產(chǎn)企業(yè)以及行業(yè)監(jiān)管部門的重視。

目前，我國(guó)液體乳中抗生素殘留多采用國(guó)標(biāo)GB/T 4789.27-2008《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)》的方法，近年來隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的檢驗(yàn)手段被用于生鮮乳中抗生素殘留量的檢測(cè)。然而，就我國(guó)乳品業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈以及原料乳收購模式而言，一些對(duì)實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)人員要求較高的檢測(cè)方法，如光譜法、色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)其靈敏度高于微生物法[3]，在基層難以推廣。乳品企業(yè)與各級(jí)監(jiān)督部門需要簡(jiǎn)便、快速、敏感性高且相對(duì)準(zhǔn)確的檢測(cè)方法用于對(duì)原料乳、生鮮乳抗生素殘留的快速篩查以滿足日趨嚴(yán)格的殘留限量要求。

本文將用兩種方法檢測(cè)乳品業(yè)中常用的β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類抗生素殘留量研究，并與國(guó)標(biāo)TTC法進(jìn)行了比較和分析。

1 儀器、試劑和菌種

SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法抗生素檢測(cè)儀及試劑盒（北京安普生物技術(shù)有公司；型號(hào)：SNAPshotTM）；尖蓋恒溫水浴搖床（北京五洲東方科技有限公司；型號(hào)：WB22）、培養(yǎng)箱(上海科端生物科技有限公司；型號(hào)：SHELLAB)、10 mL（1 mL）滅菌吸管、1000 μL（200 μL）加樣槍及配套槍頭；15 mm×150 mm試管等。

選取市售無抗巴氏殺菌奶作為陰性對(duì)照（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，確認(rèn)其中不含β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類抗生素[4-6]）以及抗生素標(biāo)樣（均為Sigma品牌）；脫脂奶粉：按國(guó)際法還原成復(fù)原乳，經(jīng)115℃15 min滅菌，4℃保存；4%TTC指示劑：121℃15 min滅菌，避光4℃保存；磷酸鹽緩沖溶液（pH6.0）：121℃20 min滅菌，4℃保存；0.1 mol/L鹽酸溶液；SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法抗生素檢測(cè)儀試劑盒（β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類抗生素）；ECLIPSE 50試劑盒。

嗜鏈球菌菌種（ATCC19258）培養(yǎng)、保存、傳代[7]。

抗生素稀釋：將各類抗生素用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋定容至濃度為1000 μg/mL儲(chǔ)備液，配置后置于4℃中保存一周。用上述的儲(chǔ)備液用市售的無抗奶稀釋配制成 100、50、20、10、6、4 、2 μg/mL 作為模擬樣品。需使用當(dāng)天配制。

2 方法和討論

2.1 TTC法

國(guó)標(biāo)嗜熱鏈球菌抑制法（TTC法）按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T4789.27-2008《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)》[7]。

TTC 法其原理是：2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）會(huì)與活菌體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的代謝產(chǎn)物。將液體乳高溫殺菌后添加嗜熱鏈球菌菌液，37℃培養(yǎng)一段時(shí)間后加入TTC進(jìn)行顯色。若該液體乳樣品中不含抗生素或含量低于檢測(cè)限，嗜熱鏈球菌會(huì)繼續(xù)增殖將TTC還原并產(chǎn)生紅色物質(zhì)（陰性結(jié)果）；相反，若樣品中含有高于檢測(cè)限的抗生素，則菌體生長(zhǎng)受到抑制，指示劑TTC不能被還原，檢測(cè)試管將保持其液體乳原有的白色（陽性結(jié)果）。TTC法是較早用于液體乳中抗生素殘留定性檢測(cè)的方法。也是我國(guó)實(shí)驗(yàn)室里普遍使用的方法。其成本低廉、操作簡(jiǎn)單，但由于需要增菌步驟，需要近3 h才能完成檢測(cè)。此外，該方法會(huì)受到接種量、菌株的活性、滅菌脫脂乳的營(yíng)養(yǎng)情況、TTC溶液的保存情況等多種因素的干擾，致使其檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不太穩(wěn)定[8]。當(dāng)液體乳中抗生素含量在檢出限附近時(shí)，如陽性為乳白色，陰性由于TTC的作用為粉紅色，但有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)這兩者之間的顏色，人為難以判讀的現(xiàn)象，造成了試驗(yàn)結(jié)果誤差。

在液體乳中加標(biāo)后的抗生素殘留結(jié)果，見表1。

由表1可見：TTC法對(duì)于以青霉素、阿莫西林為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素較為靈敏，檢出限為10 μg/mL~20 μg/mL；對(duì)于四環(huán)素族的抗生素，該方法的檢出限為100 μg/mL；而磺胺類抗生素在高濃度下不能抑制嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)，嗜熱鏈球菌都被TTC還原成紅色物質(zhì)，TTC法不能用于精確檢驗(yàn)牛乳中磺胺類藥物殘留是否超過最高限量(100 μg/mL)[9]。

表1 嗜熱鏈球菌抑制法檢測(cè)結(jié)果Table 1 Streptococcus thermophilus cultured suppression method test results

2.2 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法

按操作手冊(cè)規(guī)定的方法進(jìn)行。

加樣于具有酶標(biāo)記物的配套試管中，搖勻，與試劑盒置于加熱器上加熱5 min。加樣于樣品孔中，當(dāng)激活圓環(huán)開始退卻時(shí)，按SNAP鍵。反應(yīng)4 min；SNAP讀數(shù)儀讀取。檢測(cè)讀數(shù)≤1.05時(shí)判為陰性，＞1.05時(shí)判為陽性。

SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)原理基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫技術(shù)。樣品內(nèi)的抗生素與試管內(nèi)的酶標(biāo)記抗體在（45±5）℃共同保溫下充分結(jié)合，剩余的酶標(biāo)記抗體與試劑盒上內(nèi)置的抗生素結(jié)合，然后進(jìn)行洗滌，通過酶的作用分解可形成有色物質(zhì)測(cè)定色度并與參照物對(duì)照，就可以確定結(jié)果是否陰陽性。

以SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法檢測(cè)液體乳中抗生素殘留結(jié)果，見表2。

表2 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果Table 2 SNAP double flow enzyme-linked immunosorbent method test results

由表2可見：SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法對(duì)于β-內(nèi)酰胺類抗生素檢出限可達(dá)3 μg/mL~4 μg/mL；對(duì)于四環(huán)素族的抗生素，檢出限為 50 μg/mL（四環(huán)素為20 μg/mL）；對(duì)于磺胺類抗生素該方法的檢出限為10 μg/mL。樣品中的抗生素含量在試劑盒標(biāo)準(zhǔn)值附近時(shí)，在反復(fù)檢測(cè)中可能會(huì)出現(xiàn)幾次檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)值上下浮動(dòng)的現(xiàn)象。經(jīng)美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）規(guī)定同一樣品在三次檢測(cè)中有兩次在標(biāo)準(zhǔn)值上線，就判為陽性。

SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法最大的優(yōu)勢(shì)是檢出限低，檢測(cè)便捷迅速。可見，在抗生素低濃度的一定范圍內(nèi)，SNAP檢測(cè)法的靈敏度高于TTC法。SNAP檢測(cè)試劑盒體型輕巧、便于攜帶、使用簡(jiǎn)單，10 min左右便可作出定性檢測(cè)的結(jié)果。其作為一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)方法，能快速篩查出陽性和國(guó)標(biāo)法難以判斷的樣品，非常適合野外加工廠環(huán)境及有關(guān)部門現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法時(shí)的使用。在TTC法易出現(xiàn)假陽、陰性現(xiàn)象，特別是嗜熱鏈球菌量添加對(duì)結(jié)果影響很大，添加數(shù)量過多會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果，加入的量過少，則出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。而SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法所受的實(shí)驗(yàn)外界影響很少，無假陽、陰性現(xiàn)象。SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法對(duì)常用抗生素類都有其相應(yīng)的耗材，能對(duì)樣品中的抗生素進(jìn)行分類，這是TTC法和ECLIPSE50微生物抑制法所不能做到的。但SNAP法的基本原理決定了其針對(duì)不同種類的抗生素檢測(cè)需要在試劑盒中包被相應(yīng)的抗生素。對(duì)于一個(gè)待測(cè)樣品，一次檢驗(yàn)僅能判定其是否含有某一類特定的抗生素，而無法檢測(cè)其抗生素殘留總量，所使用的耗材是較昂貴的進(jìn)口產(chǎn)品，相應(yīng)的檢測(cè)成本就會(huì)大大的提高，也成為SNAP法在基層推廣的弊端之一。SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法的另一缺點(diǎn)是，該試劑盒中的膜的孔徑非常細(xì)小，無法用于檢查流動(dòng)性不佳的樣品。因此，該方法僅適用于新鮮的液體乳樣品。

2.3 ECLIPSE50微生物抑制法

按操作手冊(cè)規(guī)定的方法進(jìn)行。

96孔板的各個(gè)微孔中包被芽孢桿菌、培養(yǎng)基和pH指示劑。加入待測(cè)樣品并在65℃下培養(yǎng)微孔板，若樣品中不含抗生素，孢子生長(zhǎng)發(fā)育并產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)基的pH值，在pH指示劑的作用下，原來的藍(lán)(紫)色將變成黃(綠)色；若樣品中含有某種抗生素，孢子的萌芽和發(fā)育都將受到抑制，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（2 h~3 h），培養(yǎng)基顏色不會(huì)發(fā)生改變，保持其原有的紫色。

ECLIPSE50微生物抑制法檢測(cè)液體乳中抗生素殘留結(jié)果，由表3可見：該方法對(duì)于β-內(nèi)酰胺類抗生素檢出限可達(dá)4 μg/mL；對(duì)于四環(huán)素族的抗生素和磺胺類抗生素，其檢出限為100 μg/mL。

ECLIPSE50微生物抑制法雖然高于SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法，比TTC法依然靈敏許多。ECLIPSE50試劑盒法適用于液體乳中抗生素殘留總量的定性檢測(cè)，該方法無需復(fù)雜的樣品前處理，只需一步操作且結(jié)果直觀，而且具備高通量、可在短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品篩選的優(yōu)勢(shì)，這也是國(guó)標(biāo)TTC法與SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法所不能比擬的。但也只是對(duì)抗生素的總量的測(cè)定，不能系統(tǒng)的分類。比起TTC法，其適用性廣泛。TTC法只適用于四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖甙類的檢測(cè)。當(dāng)然，ECLIPSE50試劑盒也較為昂貴，對(duì)于普通乳品廠、奶站，以及基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)依然難以承受。

表3 ECLIPSE50微生物抑制法檢測(cè)結(jié)果Table 3 Microbial suppression method ECLIPSE50 testing results

3 結(jié)論

自去年“三聚氰胺”及光明“無抗奶”事件之后，乳制品中的抗生素殘留日益受到我國(guó)政府及社會(huì)各界的重視。液態(tài)乳中的抗生素殘留檢測(cè)方法眾多，其中許多方法已經(jīng)相當(dāng)成熟并被寫入標(biāo)準(zhǔn)。就本文介紹的三種液態(tài)乳中抗生素殘留量定性檢測(cè)方法而言，各有其優(yōu)勢(shì)及適用范圍。

表4 3種方法對(duì)3類抗生素的限量比較Table 4 Three methods of 3 kinds of antibiotics is limited

如表4所示，SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法的靈敏度最高，其次是ECLIPSE50微生物抑制法，TTC法檢出限及靈敏度較差。β-內(nèi)酰胺類作為原料乳中最常用的抗生素，此3種方法對(duì)其檢測(cè)靈敏度和精確度相比其他2類抗生素要高。而SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法對(duì)四環(huán)素類和磺胺類的檢出限也未及高效液相色譜法高靈敏度[5-6]。但此3種方法的共同特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室及檢驗(yàn)人員要求較低。國(guó)標(biāo)TTC法作為國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用方法，其影響因素大大的局限了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。SNAP法相對(duì)而言精確、靈敏高，但一次性僅能檢測(cè)單一種類的抗生素，且價(jià)格昂貴；ECLIPSE50微生物抑制法具有高通量、可在短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品篩選的優(yōu)勢(shì)，但也是總量上的檢測(cè)，同樣成本高昂。研究一種經(jīng)濟(jì)便捷且能保證檢出限及靈敏度的檢測(cè)方法，用于液體乳中抗生素殘留的快速篩選；或是早日實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有快速檢測(cè)試劑盒的國(guó)產(chǎn)化，以降低檢測(cè)成本，依然是擺在各相關(guān)部門眼前的一項(xiàng)迫切任務(wù)。

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Emulsified Rapid Detection of Antibiotic Residues Method of Inquiry

YU Yi，HU Xue-lian，CHAO Qiang-guo，XIONG Wei
（Shanghai Institute Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233,China）

2010-01-15

俞漪（1978—），女（漢），助工，本科，研究方向：食品中抗生素殘留。