酶法水解羅非魚蛋白及產物脫腥

曾紹東，歐仕益，吳建中

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）

酶法水解羅非魚蛋白及產物脫腥

曾紹東，歐仕益，吳建中*

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）

采用Alcalase蛋白酶酶解羅非魚蛋白，優化水解的各項參數。利用D113型陽離子交換樹脂脫除酶解液腥味。結果表明：羅非魚肉經冷凍處理有利于提高水解度（DH），Alcalase最佳酶解條件為pH8.0，溫度60.0℃、每克底物蛋白中酶加量為3000 U，液料比3∶1(g/g)、酶解時間3.0 h，在此條件下水解度為18.23%。酶解液經D113樹脂處理后，腥味顯著降低，溶液顏色透明澄清，略帶金黃色，感官品質有所改善。

羅非魚；酶解；陽離子交換樹脂；脫腥

Abstract:Alcalase was used to hydrolysis tilapia protein and the hydrolysis parameters were optimized.D113 cation exchange resin was used to deodorization.Results showed that freezing pretreatment increase the degree of hydrolysis（DH）and a maximum DH of 18.23%was obtained by hydrolysis for 3.0 h using alcalase at 60.0 ℃,pH8.0,enzyme dosage 3000 U/g（basis of substrate protein）,and liquid/solid ratio 3∶1(g/g).A clarified product with low fishiness,light golden color was obtained after treated with D113 resin.

Key words：tilapia;enzymatic hydrolysis;cation exchange resin;deodorization

魚蛋白經酶解制備的低聚肽據報道有多種功能性[1-2]，可以開發成相應保健食品，具有較大的社會、經濟價值。使用蛋白酶水解羅非魚蛋白制備低聚肽可以提高羅非魚的加工水平，擴寬產品應用范圍，產生較好的經濟價值。但由于存在于魚皮黏液及魚血液中的δ-氨基戊酸、δ-氨基戊醛和六氫吡啶類化合物等共同作用形成魚腥味，且在儲藏和加工過程中氧化三甲胺降解為三甲胺、二甲胺等物質，使得腥味增加[3]，通過酶解制得的酶解液腥味重，感官品質差，不易于被人們所接受，所以在利用魚蛋白制備活性肽時酶解液的脫腥是一個關鍵問題。以羅非魚肉為原料，優化Alcalase蛋白酶酶解條件，利用D113型陽離子交換樹脂脫除酶解液中的腥味，改善其感官品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮尼羅羅非魚：鮮活，大小均一，體重為250 g～400 g，購于暨南大學菜市場；D113型陽離子交換樹脂：天津南開大學化工廠；Alcalase2.4L堿性蛋白酶：諾維信公司；考馬斯亮藍G-250：北京鼎國生物技術有限公司，分析純；牛血清白蛋白：上海伯奧生物科技有限公司，層析純；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸等均為分析純。

1.2 試驗儀器

SHA-B型恒溫振蕩器：江蘇金壇宏華儀器公司；UV-9600紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；pH計：上海精密科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋：江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 D113樹脂的預處理

首先用乙醇浸泡24 h，使之充分溶脹，然后用去離子水將醇洗凈，其后用2倍體積的1 mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用去離子水沖洗樹脂直至排出水接近中性為止，最后用2倍體積1 mol/L HCl溶液浸泡4 h，用去離子水洗至中性即可[4]，使用前抽濾脫水備用。

1.3.2 羅非魚肉的制取

將購買的鮮活羅非魚，迅速運至實驗室，去內臟和魚鱗，清洗，取魚肉，瀝干，絞碎備用。

1.3.3 預處理對水解度的影響

取新鮮羅非魚肉，分別在-18℃冰箱中冷凍處理一周以及在80、100℃下分別加熱處理5、30 min，加酶酶解3 h，測定水解度并確定最佳預處理工藝。

1.3.4 Alcalase酶解條件的優化

取冷凍羅非魚肉（蛋白質含量為18.6%）室溫解凍，按一定的比例（g/g）加水勻漿。放入恒溫水浴鍋中，保溫至所需溫度，調至試驗所需pH值，按設定量加入Alcalase開始酶解，酶解過程中滴加1.0 mol/L NaOH保持pH值恒定，每隔一定時間記錄消耗NaOH的體積數測定水解度，優化酶解的條件。

1.3.5 酶解液樹脂脫腥

按照酶解的最優條件加酶酶解羅非魚肉，酶解完成后沸水浴10 min滅酶活，4000 r/min離心15 min，取上清液即為酶解原液。根據實驗室前期試驗的結果，酶解原液采用D113型樹脂脫腥：取適量體積酶解液原液置于具塞錐形瓶中，調pH值至5.0，加入酶解液體積5.0%重量的D113型樹脂，室溫下以150 r/min的轉速振蕩吸附1 h，分離樹脂即得脫腥酶解液。

1.3.6 分析測定方法

1.3.6.1 酶活力的測定

參照GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》，福林法進行測定。

1.3.6.2 DH的計算[5]

式中：h為被裂解的肽鍵數；B為耗堿量，mL；Nb為堿的摩爾濃度，(mol/L)；α為α-氨基的平均離解度；MP為蛋白質質量，g；htot為蛋白質底物的總肽鍵數。

1.3.6.3 蛋白質（肽）含量的測定[6]

考馬斯亮藍法原理是通過范德華力將染料分子與蛋白質或肽分子結合，形成在595 nm下有最大吸收的結合物[7]，從而可以對蛋白質和肽進行測定，具體方法是：取酶解液0.5 mL，加去離子水 0.5 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液，靜置5 min后比色測定溶液在595 nm下的吸光值A，按照牛血清白蛋白標準蛋白質曲線線性回歸方程y=203.3x-1.0016（R2=0.9992），x為595 nm下吸光值，y為蛋白質含量（μg），將吸光值A595 nm轉化為蛋白質（肽）含量。

1.3.6.4 腥味感官評價[8-9]

評定過程是由8名(4男4女)經過訓練的感官評價員在食品感官實驗室內進行，評定室溫為25℃左右。按照感官評定的規范要求，每次的樣品數最多不超過5個，評定過程中不得相互交流，每評定完一個樣品后，間隔幾分鐘再評定下一個樣品，以蒸餾水作為參照（分值為0），根據表1的評分標準進行評分，評分值就是腥味值，得出的平均值表示水解液的腥味程度。

表1 脫腥效果的腥味評定標準Table 1 Standards of grading for fishiness evaluation

2 結果與分析

2.1 羅非魚肉預處理方法對DH的影響

對羅非魚肉原料進行不同方法預處理，加酶酶解并測定DH，預處理方法對DH的影響見圖1。

圖1 不同預處理方法對DH的影響Fig.1 Effect of pretreatment on degree of hydrolysis of tilapia protein

由圖1可以看出，不同預處理方法對酶解水解度的影響不同，經過加熱預處理的樣品水解程度明顯低于新鮮和冷凍處理的樣品，加熱處理的各樣品隨著加熱溫度和時間的不同，蛋白質的水解程度也不同。其中冷凍處理后魚肉的水解度最高，分析其中原因肯能是①未經加熱處理的羅非魚肉保留了天然的內源蛋白酶，酶解過程中內源蛋白酶與外加蛋白酶具有協同作用。②冷凍過程造成魚肉細胞的破裂，促進內源蛋白酶的溶出，進一步提高了水解度。此外新鮮魚肉的水解度也高于加熱處理后的羅非魚肉，其原因可能同樣是因為天然的內源蛋白酶存在。

2.2 Alcalase酶解條件的確定

2.2.1 pH值對水解度的影響

固定其它指標，考察pH值對DH的影響效果，結果見圖2。

pH值直接影響到酶和底物蛋白分子的某些解離基團的解離狀態，從而影響到酶和底物的結合或催化，使蛋白酶的水解效果受到影響[10]。從圖2可以看出，在試驗選取的pH值范圍內，隨著pH值的增大蛋白質的水解度先升后降，在pH為8.0時水解度達到最高，所以選擇最適pH值為8.0。

2.2.2 溫度對水解度的影響

固定其它指標，考察酶解溫度值對DH的影響效果，結果見圖3。

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH value on degree of hydrolysis of tilapia protein

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis of tilapia protein

溫度對酶促反應速率的影響表現在兩個方面，一方面是當溫度升高時，反應速率加快。另一方面由于酶是蛋白質，隨著溫度的升高，使酶逐漸變性而失活，引起酶反應速率的下降，所以溫度過高或者過低都會影響反應速率[10]。從圖3可以看出，在試驗選取的溫度范圍內，蛋白酶的酶解效果隨著溫度的上升呈現先上升后下降的趨勢，在60.0℃時水解度最高，所以選擇最佳溫度為60.0℃。

2.2.3 酶添加量對水解的影響

固定其它指標，考察蛋白酶添加量對DH的影響，結果見圖4。

從圖4可以看出，隨著酶加量的增加，羅非魚蛋白的水解程度增加。當每克底物蛋白中酶加量超過3000 U時，水解度的增加趨勢變緩慢。在制備蛋白水解液時酶的用量要控制得當，酶加量太低，水解度達不到較好的水平；酶加量太高，則會增加蛋白酶的成本投入。因此，綜合考慮，選取每克底物蛋白中酶添加量為3000 U。

圖4 酶加量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis of tilapia protein

2.2.4 料液比對水解度的影響

固定其它指標，考察料液比對DH的影響，結果見圖5。

圖5 液料比對水解度的影響Fig.5 Effect of liquid/solid ratio on degree of hydrolysis of tilapia protein

液料比的大小會影響到酶與底物的結合，從而影響蛋白酶的水解效果。液料比過低，液料的黏度也相對較大，阻礙了酶和底物充分接觸，反應不易進行。液料比過高，底物與酶的接觸機會減少，導致反應速度降低，從而酶解液的水解度降低。從圖5可以看出，隨著液料比的增加，水解度逐漸上升，當液料比大于3∶1時，水解度的變化不明顯。在實際生產中，液料比太大會增加濃縮成本，考慮到各方面因素，液料比選擇在3∶1 最合適。

2.2.5 酶解時間對水解度的影響

在酶解條件為pH8.0，溫度60.0℃、酶加量每克底物蛋白為 3000 U、液料比為 3∶1(g/g)，加入 Alcalase酶解經冷凍處理的羅非魚肉，酶解時間對DH的影響見圖6。從圖6可以看出，羅非魚酶解過程符合典型水解曲線。隨著酶解時間的延長，蛋白質水解度增大，在5h的酶解過程中，蛋白質水解度的增加主要集中在反應前2 h，3 h以后水解度變化趨于平緩，增加酶解時間已不能提高水解度，且為了防止酶解時間過長而導致酶解液產生異味，Alcalase酶解反應的合適時間定為3.0 h，在此條件下酶解液的水解度為18.23%。

圖6 酶解時間對水解度的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of tilapia protein

2.3 D113型樹脂脫腥

表2 樹脂處理前后酶解液的感官和理化特性Table 2 The sensory and chemi-physical properties of hydrolysate before and after resin treatment

從表2可以看出，羅非魚酶解液經D113陽離子交換樹脂處理后腥味有顯著的下降。酶解液原液腥味很重，呈深黃褐色，感官品質差，讓人難以接受。經過D113型樹脂處理后腥味分值下降到1.4，略帶金黃色，溶液澄清透明，感官品質有所改善。這可能是在呈酸性條件下，酶解液中的二甲胺、三甲胺等腥味物質更多地以陽離子的形式存在，與D113陽離子樹脂上的基團發生了交換吸附，從而達到脫腥的效果。

3 結論

1)羅非魚肉經冷凍預處理可以適當提高酶解水解度。

2)Alcalase蛋白酶酶解羅非魚肉的最佳條件為：pH8.0，溫度60.0℃、酶添加量為每克底物蛋白3000 U，液料比3∶1(g/g)、酶解時間3.0 h，在此條件下制得的酶解液水解度為18.23%。

3)羅非魚酶解液經D113型陽離子交換樹脂處理后腥味分值為1.4，與原液相比腥味顯著降低，處理后的酶解液澄清透明，略帶金黃色，感官品質有所改善。

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Research of Enzymatic Hydrolysis of Tilapia Protein and Deodorization of Hydrolysates

ZENG Shao-dong,OU Shi-yi,WU Jian-zhong*
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong,China）

2010-05-17

廣東省教育部產學研專項項目（2009B090200012）；粵港關鍵領域重點突破項目（2009Z026）；佛山市禪城區項目（2008B1043）

曾紹東（1983—），男(漢)，碩士研究生，主要從事功能性食品研究。

*通信作者：吳建中，男，副教授。