天麻多糖的結構表征

朱曉霞,張勇,羅學剛

（西南科技大學材料科學與工程學院，四川綿陽621010）

天麻多糖的結構表征

朱曉霞,張勇,羅學剛

（西南科技大學材料科學與工程學院，四川綿陽621010）

對分離提純得到的川產天麻多糖結構進行分析，結果如下：天麻粗多糖重均分子量為4.23×105，分散系數3.66，最大值達到1.38×106u。經HPLC分析，GPSa的分子量為4.97×105u，主要由葡萄糖構成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，其鼠李糖∶甘露糖∶葡萄糖=1∶1.07∶67.24。經紅外光譜（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）結構分析確定其糖鏈主要結構為α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

天麻;多糖;結構

Abstract:Analyzing the structure of the Gastrodia elata BL polysaccharides which produce from SichuanProvince and the results showed those as follow.The weight-average molecular weight of GPS is 4.23×105u,dispersible modulus is 3.66 and the max molecular weight is 1.38×106u.The molecular weight of GPSa is 4.97×105u by analyzed with HPLC.It was made up of glucose,little rhamnose and mannose（the rate is 67.24∶1∶1.07）.Then through IR,1H,13C NMR,the results showed that the main polysaccharide chain was α-(1→4).

Key words：Gastrodia elata BL.;polysaccharides;structure

多糖的結構是其生物活性和功能的基礎，認識和了解多糖的結構有助于更好地利用和開發多糖[1]。多糖的化學結構與其生物功能關系密切，與蛋白質相似，多糖也是大分子，結構上可以分成一級、二級、三級和四級結構[2]。多糖的一級結構是指糖基的組成，糖基排列順序，相鄰糖基的連接方式，異頭碳構型以及糖鏈有無分支，分支的位置與長短等。由于多糖結構的復雜性,在多糖一級結構的分析中,往往需要使用多種方式的測試手段獲得糖鏈的一級結構信息，目前國內植物多糖的研究報道較多[3-5]。本文對本實驗室分離提純所得到的天麻多糖GPSa進行凝膠過濾分子量分析、單糖組分分析、紅外（IR）和核磁共振（1HNMR和1CNMR）掃描等初步表征。

1 材料和方法

1.1 原料、試劑材料及儀器

生物質化學衍生物四川省高等學校重點實驗室分離提純后所得到的多糖組分；葡聚糖標準品Dextran T-2000，T-500，T-70，T-40，T-10(Pharmacia，瑞典)。

1.2 儀器設備

Waters 2695 Alliance高效液相色譜系統：成都雅源科技有限公司；Empower色譜工作站：美國Waters公司；Shodex OHpak SB-804HQ多糖分析柱：江蘇漢邦科技有限公司；Shodex OHpak SB-G保護柱：浙江大學智達信息工程有限公司；Waters 2420 ELS Detector：美國Waters公司；示差檢測器：日本Shodex公司。

2 方法

2.1 GPSa理化性質分析

1）物理性質：觀察多糖形狀、顏色、氣味，在水中及有機溶劑中的溶解性及pH值。

2）化學性質：苯酚－硫酸法反應，茚三酮法檢測蛋白質，淀粉－KI試紙試驗。

2.2 純度檢測

取測試樣品GPSa 1 mg溶于1 mL蒸餾水，10000 r/min離心10 min，取上清10 μL上樣，記錄洗脫曲線用于判定該多糖組分的純度。

本實驗室的HPSEC的具體測試條件如下：

Waters高效液相色譜系統（2695 HPLC Pump，Inline Degasser，2414Refractive Index Detector 與 2487 DualλAbsorbance Detector平行檢測，TSK PWXL 4000-3000串聯柱）。

流動相為pH為7.0的0.1mol/LNaH2PO3和0.3mol/L NaNO3。

流速為 0.6 mL/min，柱溫（30±0.1）℃。

2.3 分子量測定

以不同標準分子量的葡聚糖Detxran-T系列（分子量4000至200萬的10個標準品）作對照，用高效液相色譜法測定，由lgMw對tR作圖獲得標準曲線，然后在相同條件下獲得樣品層析圖譜，通過GPC計算機軟件計算分子量。

2.4 單糖組成測定

本文采用氣相色譜法，分析時由于樣品在氣相中傳遞速度更快，再加上應用毛細管柱、程序升溫技術和采用更靈敏的檢測器（如氫離子火焰化檢測器），使得糖類分離具有選擇性強、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優點。但是由于糖類不容易揮發，必須預先進行衍生化，成為易揮發、對熱較穩定的衍生物。在糖進行衍生化這一步驟，由于衍生化不充分，以及生成非目標衍生物的其它副產物，易對分析造成干擾。

2.5 紫外光譜分析

稱取樣品GPSa 3 mg，用蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液，在200 nm～300 nm下進行紫外全掃描。

2.6 紅外光譜（Infrared spectroscopy，IR）分析

紅外操作：取GPSa2mg充分干燥的組分，與200mg經干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中細細研磨均勻，再經壓片機壓片，上機4000cm-1～400cm-1波長范圍內掃描。

2.7 一維核磁共振（NMR）

NMR檢測：取50 mg天麻多糖單組分GPSa溶于0.5 mL D2O，在常溫下，上機進行分析。

3 結果與討論

3.1 GPSa理化性質

呈白色粉末狀固體，無異味，可溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑，pH值為6.3。苯酚－硫酸反應陽性，茚三酮反應為陰性，說明多糖中無蛋白質存在；此多糖不能使淀粉－KI試紙變蘭，說明GPSa為非淀粉多糖。

3.2 分子量確定

3.2.1 標準曲線

取標準葡聚糖 Dextran T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10,配制成2%的溶液，12000 r/min離心10 min，上清液用來制作標準曲線，進樣量10 μL，標準曲線見圖1。

以保留時間tR對標準品Mw的對數值進行線性回歸，得回歸方程為lgMw=-0.2813×tR+9.693,R2=0.9955，Mw 線性范圍為 104u～2×106u。

3.2.2 粗多糖分子量測定

粗多糖的分子量確定：將提取的天麻多糖除蛋白后，冷凍干燥成粉末，送樣到中國科學院成都分院分析測試中心測定。結果如表1。

表1 粗多糖分子量Table 1 Molecular weight of wide polysaccharide

常用的平均分子量有以數量為統計權重的數均分子量(Mn)和以重量為統計權重的重均分子量(MW)。天麻粗多糖的分散系數為3.66，說明天麻粗多糖分子量分布特別分散，最大值達到1.38×106u。

3.3 純度鑒定及GPSa分子量測定

GPSa的HPLC圖譜如圖2所示，GPSa經高效液相色譜測定其在HPLC中為單一對稱峰，表明其為均一組分。由圖2可知，組分GPSa的洗脫時間為14.21 min，根據標準曲線可得分子量為4.97×105u。

3.4 單糖組成

圖3為標準糖樣中單糖的氣相色譜圖與天麻多糖的氣相色譜圖。

從GC圖譜可知，GPSa主要是由葡萄糖構成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。15.886,20.877 兩處峰在標準品中未出現，其對應的單糖在樣品中含量很小，不影響樣品主要組成。

圖2 GPSa的HPLC圖譜Fig.2 HPLC elution of GPSa

圖3 標準糖樣中單糖的氣相色譜圖與天麻多糖的氣相色譜圖Fig.3 GC of the monosaccharides in standard sample and GPSa

3.5 紫外分析

圖4為GPSa紫外掃描圖。

對多糖在200 nm～300 nm進行紫外全掃描，結果顯示在280 nm和260 nm處都沒有吸收峰，說明此均一多糖不含蛋白質和核酸。

3.6 紅外光譜分析

圖5為GPSa的紅外光譜圖。

圖4 GPSa紫外掃描圖Fig.4 The UV scanning curve of GPSa

圖5 GPSa的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of GPSa

從紅外光譜分析，該糖具有多糖特征，多糖的吸收譜帶：其在3434 cm-1有強且寬的-OH吸收峰，系多糖上的－OH形成的分子間、內氫鍵；在2925 cm-1附近的峰為飽和C-H伸縮振動(為-CH、-CH2的吸收峰)信號，中等強度；在1630 cm-1左右的峰是多糖水合振動峰；在1730 cm-1沒有糖醛酸的吸收峰；在1300cm-1～1250 cm-1處沒有吸收峰，表明無磷酸基取代；1247cm-1處的應為磺酸基的S=O伸縮振動峰；1103cm-1、1080cm-1、1024 cm-1三個峰為吡喃糖環特征吸收峰，是其糖苷鍵C-O-C的非對稱振動峰，吸收很強；紅外光譜在890cm-1附近無吸收峰，而在837 cm-1（844±8）cm-1峰范圍內，為α構型）處形成峰，表明組成單糖為α－D－葡萄吡喃糖，另外在875 cm-1和810 cm-1處無吸收，表明不含甘露吡喃糖、半乳吡喃糖。

3.7 一維核磁共振

圖6和圖7分別是天麻多糖單組分GPSa的1HNMR和13CNMR，從譜圖中可得出葡聚糖的主要信息。

圖6 GPSa的1H核磁共振譜圖（30℃）Fig.6 1H NMR spectrum of GPSa at 30℃

在1H譜中，5.44×10-6g/L處有異頭碳C1上質子的氫位移，表明這些葡萄糖殘基均為α型吡喃糖，這與紅外光譜分析一致。在13C譜中，102.466×10-6g/L處化學位移表明C-1發生取代；在87.5×10-6g/L左右沒有發生互相位移，表明沒有C-3發生取代；在69×10-6g/L處沒有化學位移，表明沒有發生取代的C6。所以此糖鏈可能的主鏈結構為1－4連接。

4 結論

1)單組分GPSa的理化性質：呈白色粉末狀固體，無異味，可溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑，pH值為6.3。GPSa不含蛋白質，為非淀粉多糖。

2)天麻粗多糖重均分子量為4.23×105u，分散系數3.66，最大值達到 1.38×106u。經 HPLC 分析，GPSa的分子量為4.97×105u。

3)單組分GPSa經GC分析：GPSa主要是葡萄糖構成，還含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。

4)單組分GPSa經紅外光譜（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）結構分析確定其糖鏈為α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

[1]楊世林,蘭進,徐錦堂.天麻的研究進展[J].中草藥,2000,31(1)：66-69

[2]張宏杰,周建軍,李新生.天麻研究進展[J].氨基酸和生物資源,2003,25(1)：17-20

[3]楊云.孟江,馮衛生.大棗酸性多糖ZJ-6的化學研究[J].食品科學,2004,25(5)：55-58

[4]林娟,邱宏端,林霄.甘薯多糖的提取純化及成分分析[J].中國糧油學報,2003,18(2)：64-66

[5]劉方明,李志孝,孟延發.紅芪多糖RHG的分離純化及化學結構[J].藥學學報,1997,32(8)：603-606

Studies on Structure Characterization of Gastrodia Elata BL Polysaccharides

ZHU Xiao-xia，ZHANG Yong，LUO Xue-gang
（School of Material Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-10

朱曉霞（1982—），女（漢），助教，碩士，從事天然生物大分子研究。