微生物篩選法檢測輻照食品的研究

趙良娟，鄭文杰，張宏偉，李宏虹，趙宏

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300201）

微生物篩選法檢測輻照食品的研究

趙良娟，鄭文杰*，張宏偉，李宏虹，趙宏

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300201）

建立一種輻照食品的微生物篩選方法。研究采用細菌內毒素/革蘭氏陰性菌微生物篩選法檢測不同輻照劑量的雞肉、牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁，及進出口肉餅、糖果等食品。研究結果，表明該方法具有對多種輻照食品的初篩功能，準確性好，檢測靈敏度≥1.5 kGy。細菌內毒素/革蘭氏陰性菌微生物初篩法操作簡便、快速，可以作為多種輻照食品的初篩鑒別檢測方法。

微生物篩選法；輻照食品；革蘭氏陰性菌；內毒素

Abstract：To establish microbiological screening method for detection of irradiated food.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was applied to detect chicken，beef，mutton，pork，fish bolus，shrimp bolus，crab meat sleeve-fish irradiated at different absorbed dose and bakemeat and sugar.The preliminary studies demonstrated that the microbiological screening method can screen the multi-irradiated foods,and have high accuratity and the sensitivity is 1.5 kGy.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was simple，fast and can be used as screening method to detect the irradiated foods.

Key words:microbiological screening；irradiated foods;Gram negative bacteria(GNB);endotoxin

近年來輻照食品的潛在安全性問題存在爭議，盡管在目前允許的食品種類，輻照劑量的作用下的輻照食品是安全的，但不當的輻照會對食品的顏色、味道、營養產生一些副作用，比如脫色、有臭味、破壞一些營養成分，輻照殘留也對人的健康存在安全隱患。

而且隨著進出口貿易的發展，輻照食品管理中標識的問題已得到歐盟各國及日、韓等國的重視，其影響很可能類似于對轉基因食品的要求一樣波及全球[1]。目前，美國、英國、德國等國家對食品輻照有比較詳細的要求，對于食品種類、輻照劑量、輻照設施、食品輻照的標示都有明確的規定，強調“只有得到許可和經批準的輻照設施才能為特定的目的處理特定的食品”。因此，在日益嚴峻的食品安全問題和進出口貿易情況下，急需建立輻照食品的鑒別檢測技術的研究。

本研究擬建立一個輻照食品的細菌內毒素/革蘭氏陰性菌微生物快速篩選方法[2]，為輻照食品的初篩鑒別檢測研究提供試驗依據，對保證進出口貿易的順利發展和保障人民的健康具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑

酪蛋白消化酶、緩沖蛋白胨鹽溶液（含有酪蛋白消化酶和氯化鈉）、牛奶瓊脂培養基、革蘭氏陰性菌選擇性培養基（含有牛奶瓊脂和乳酸鏈球菌素）：美國BD公司；營養瓊脂培養基：北京陸橋公司；結晶紫溶液：天津市佳興化工工貿有限公司；青霉素G溶液：美國Sigma公司；無內毒素水：美國ACC或廈門鱟試劑廠；內毒素標準品（10 EU/mL）、鱟試劑（靈敏度0.5 EU/mL：規格0.1 mL）：廈門鱟試劑廠；未輻照新鮮雞肉、牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品：均購自天津菜市場；分別經鈷 60 輻照 1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等8個輻照劑量的雞肉樣品；分別經鈷60輻照5 kGy的牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品。

1.1.2 主要儀器與設備

電子天平（感量為0.001 g）：瑞士Mettler Toledo公司；均質器：德國IKA公司；恒溫培養箱[（21±1）℃，（37±1）℃]：德國 Memmert公司；微量移液器（20 μL~200 μL，100 μL~1000 μL）：德國 Eppendof公司；無內毒素吸頭：美國ACC公司；一次性無菌注射用針筒（100mL）：江西洪達醫療器械公司；無內毒素試管（18mm×180 mm）：美國ACC公司；一次性滅菌培養皿（直徑90 mm）：美國Corning公司；parafilm封口膜：美國parafilm公司。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復合物，它是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。食品經過一定劑量輻照后，食品中活的革蘭氏陰性菌基本上會被殺死，產生大量的細菌內毒素。通過對細菌內毒素的測定和革蘭氏陰性菌的培養計數可以估算食品中死的革蘭氏陰性菌總數與活的革蘭氏陰性菌總數。如果兩個結果的差異很大，說明該食品可能經過輻照處理。

1.2.2 樣品制備

以無菌操作稱取剪碎后的樣品10 g，置于裝有90 mL無內毒素水的滅菌無內毒素塑料袋（或容器）中，充分振搖、混勻，制成10-1樣品勻液，用于革蘭氏陰性菌計數和細菌內毒素檢測。

1.2.3 革蘭氏陰性菌計數

吸取10-1樣品勻液1 mL，加入裝有9 mL蛋白胨鹽溶液的滅菌試管中，制成10-2樣品勻液。重復相同操作，到樣品被充分稀釋（稀釋到10-5）。

傾注約10 mL制備好的營養瓊脂[保溫至（45±1）℃]于培養皿中，水平放置，待其凝固備用。然后分別在已凝固的營養瓊脂平板上涂布0.1 mL不同稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度涂布兩個平板。室溫（20℃～25℃）條件下放置90 min。再傾注約10 mL革蘭氏陰性菌選擇性瓊脂[保溫至（45±1）℃]于營養瓊脂表面。待瓊脂凝固后將平皿翻轉，（21±1）℃培養（24±1）h。若平板上菌落的直徑均＜0.5 mm，該平板應繼續培養24 h后再進行計數。

1.2.4 細菌內毒素檢測

吸取300 μL 10-1樣品勻液，加入裝有650 μL無內毒素水的滅菌無內毒素試管中，制成稀釋倍數為10-0.5的樣品勻液。重復相同操作，將10-0.5的樣品勻液依次稀釋為10-1.0、10-1.5、10-2.0……直到樣品被充分稀釋（通常稀釋到10-5）。

以內毒素標準品為陽性對照，無內毒素水為陰性對照，分別取0.1 mL不同稀釋度的樣品勻液加入含有0.1 mL鱟試劑的無內毒素試管中，混合搖勻，用paraflim 封口膜封閉管口，（37±1）℃反應（60±2）min。當試管內的內容物發生完全凝集時為陽性記為“＋”，部分凝集時記為“＋/－”，未凝集時記為“－”。

2 結果與分析

2.1 檢測靈敏度

試驗以雞胸肉為例，應用革蘭氏陰性菌計數和細菌內毒素篩選法檢測未輻照新鮮雞肉和經鈷60輻照1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等 8 個輻照劑量的雞胸肉樣品，革蘭氏陰性菌計數結果和細菌內毒素的檢測結果見表1和表2。

表1 不同輻照劑量的雞胸肉樣品革蘭氏陰性菌計數結果Table 1 Gram negative bacteria number of different irradiated chicken brests

通過革蘭氏陰性菌計數和細菌內毒素檢測結果可知，雞胸肉樣品分別經0 kGy（未輻照）和1 kGy輻照后的樣品細菌內毒素濃度與革蘭氏陰性菌數都很高，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，該劑量輻照樣品的檢測結果是未輻照樣品。而輻照劑量為 1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy時，即當輻照劑量≥1.5 kGy時，log10EU/glog10cfu GNB/g>0，該劑量范圍輻照樣品檢測結果均為疑是輻照樣品，需要進一步確證。因此該方法的檢測靈敏度≥1.5 kGy。

表2 不同輻照劑量的雞胸肉樣品內毒素檢測結果Table 2 Endotoxin of different irradiated chicken breasts

2.2 方法的適用性

試驗應用革蘭氏陰性菌計數和細菌內毒素篩選法檢測未輻照的和分別經鈷60輻照5 kGy劑量的新鮮牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁樣品。通過革蘭氏陰性菌計數和細菌內毒素檢測結果結算得到，牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸等5種食品的0 kGy（未輻照）樣品，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，檢測結果為未經輻照樣品；羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸4種食品5 kGy輻照樣品，log10EU/g-log10cfu GNB/g>0，檢測結果為疑是輻照樣品；牛肉5 kGy輻照樣品，細菌內毒素值log10EU/g<2，且革蘭氏陰性菌數也很低log10cfu GNB/g<2，檢測結果為不可確定。

蝦仁、蟹棒和魷魚3種食品的0 kGy（未輻照）和5 kGy輻照樣品革蘭氏陰性菌數很低，幾乎為0；且log10EU/g-log10cfu GNB/g均>0，檢測結果疑是輻照食品；因此懷疑蝦仁、蟹棒和魷魚3種食品可能在購買前經過某種方式處理過，可能是輻照。

2.3 自然樣品檢測

試驗中以日常檢測的出口豬肉餅20份，凝膠軟糖56份為研究對象，通過本方法進行檢測，結果如下：豬肉餅18份為疑是輻照樣品；凝膠軟糖56份均為疑是輻照樣品。

因此，研究結果進一步說明通過革蘭氏陰性菌/細菌內毒素微生物篩選法能夠對肉制品、水產品及日常進出口豬肉餅、凝膠軟糖等多種輻照食品的檢測，方法具有廣泛的適用性。

3 結論

本研究利用內毒素/革蘭氏陰性菌微生物篩選法，對 0、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy 等 8 個劑量鈷 60輻照過的無皮雞胸樣品、帶皮雞翅樣品和帶皮雞腿樣品進行輻照檢測的初步研究。研究結果表明，該方法具有對輻照雞肉樣品初篩的功能，檢測靈敏度≥1.5 kGy。

研究中又對0 kG和5 kGy兩個輻照劑量處理的牛肉、羊肉、豬肉、魚丸、蝦丸、蟹棒、魷魚、蝦仁（購自天津菜市場）進行檢測，研究結果進一步說明通過革蘭氏陰性菌/細菌內毒素微生物篩選法能夠對肉制品、水產品及日常進出口豬肉餅、凝膠軟糖等多種輻照食品進行檢測，方法具有廣泛的適用性。

因此本研究方法可以作為輻照食品的初篩鑒別檢測方法，適用于多種輻照食品的初篩檢測。

[1]董智挺.我國輻照食品現狀及發展對策[J].福建農業科技,2005(4):54-55

[2]EN 14569:2004 Foodstuffs-Microbiological screening for irradiated food using LAL/GNB procedures[s].

Detection of Irradiated Food by Microbiological Screening Method

ZHAO Liang-juan,ZHENG Wen-jie*,ZHANG Hong-wei,LI Hong-hong,ZHAO Hong
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300201,China)

2009-09-14

趙良娟（1979—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方

向：食品安全及微生物檢驗。

*通信作者：鄭文杰（1969—），女（漢），研究員，博士，研究方向：食品安全及分子生物學。