黑青稞花色素的提取工藝

趙桃，馬林，李嘉佳，杜靜君，楊娟，楊凡

（上海工程技術大學化學化工學院，上海201620）

黑青稞花色素的提取工藝

趙桃，馬林，李嘉佳，杜靜君，楊娟，楊凡

（上海工程技術大學化學化工學院，上海201620）

研究青稞花色素的提取工藝，以黑青稞為原料,考察提取溶劑、酸化劑、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數和籽粒粉碎度等7個單因素對其花色素提取率的影響，并采用二次回歸正交旋轉組合設計法建立和優化青稞色素提取的乙醇濃度、溫度、時間的回歸方程。試驗結果表明，在試驗范圍內各因子對青稞色素提取率的作用大小依次為：乙醇濃度＞時間＞溫度。根據優化的回歸方程，青稞色素的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%，溫度53℃，時間3 h，此時最大提取率為108.33 μg/g。試驗所建立的回歸模型在試驗范圍內能較準確的預測青稞色素的提取率。

青稞；花色素；提取工藝；二次回歸正交旋轉組合設計

Abstract:Black hulless barley was used to study the optimal extraction technology of anthocyanins from hulless barley.Effects of extraction solvent,acidifying agent,temperature,time,solid-solvent ratio,frequency and particle size of material on extraction yield of anthocyanins from hulless barley were determined individually.Based on the results,a three-factor quadratic regression rotational combinational design was applied to establish a regression model and to estimate the optimal conditions for maximal extraction yield.The results showed that the contributions of the three factors were：ethanol concentration ＞time＞temperature.The optimal extractingtechnology was considered to be extracted with 50%ethanol at 53℃for 3 h and the maximum yield of the anthocyanins was 108.33 μg/g.At the range of the designed condition the mathematic regression model could forecast the extraction yield of anthocyanins from hulless barley.

Key words：hulless barley;anthocyanin;extraction technology;quadratic regression rotational combinational design

青稞（Hordeum vulgare ssp.vulgare）又稱裸大麥，是禾本科大麥屬作物，在世界許多國家和地區作為主要糧食作物已有幾千年歷史。20世紀以后，隨著稻米和小麥的食用量增加，大麥的食用量急劇減少。然而20世紀80年代以來，由于青稞豐富的營養成分和特有的保健品質以及在燃料工業中的潛力，在發達國家日趨受到重視，掀起綜合研究利用的熱潮[1-5]。我國青藏高原地區是青稞的起源中心之一，擁有占全世界2/3以上的裸大麥資源，尤其富藏黑色、紫色、灰色等深色品種，如能科學合理的利用，將帶來巨大的經濟效益和社會效益，且對藏區農業種植結構的調整都將具有潛在意義。

現代研究發現，黑色食品中的天然色素（花色苷類物質）具有較強的消除體內自由基和抗氧化作用，具有延緩衰老、預防癌癥等功效[6-8]。此外，相對于合成色素，天然色素主要來源于動植物和微生物，具有安全、健康的特點[9]，利用天然物質提取食用、化妝品和醫用色素，成為當今世界色素研究和發展的主要趨勢[10]。裸大麥種皮色素同屬花色苷類色素，Deguchi T.等[11]從紫色裸大麥麩皮的發酵物中提取的花色素——單寧類紫色素，可消除機體代謝過程中產生的過多自由基，具有較強的抗氧化、抗突變和抗腫瘤等功能。目前關于對我國青稞中天然色素的相關研究還鮮報道，但通過對從西藏黑青稞種皮中的黑色素的研究發現，該類色素也具有優異的抗氧化性(結果另文發表)。天然色素的提取受多個因素的影響，為使提取達到最大效率，本試驗采用單因素試驗設計與二次回歸正交旋轉組合設計相結合的方法優化青稞色素提取工藝。二次回歸正交旋轉組合設計是將回歸正交設計與旋轉設計組合起來的一種方法，它不僅保留了回歸正交設計的優點，如試驗布點分散均勻，試驗次數少，還部分地消除了回歸系數間的相關性，雖然犧牲部分的正交性但是獲得旋轉性，可直接找出預測值相對較優的區域，降低了試驗成本，縮短了研究周期。它以回歸方程作為函數估算的工具，克服了正交試驗只能給出最佳因素水平組合，而無法找出整個區域上因素的最佳組合和試驗結果的最優值的缺陷[12]。本研究首次對青稞總花色素提取工藝進行探索，為開發利用深色裸大麥作為新型“天然、營養、多功能”的天然色素資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用青稞材料由西藏農科所唐亞偉惠贈。

HH-數顯恒溫水浴鍋：上海逸龍科技有限公司；pHB-4便攜式pH計：上海精密科技儀器有限公司；HR1727型攪拌機：飛利浦公司；SHZ-D型循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；AB104-N型分析天平：梅特勒-托利上海有限公司；UV-7504型單光束紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司。

試驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因素試驗設計

分別單獨考察提取劑（不同濃度甲醇、乙醇和水）、酸化劑（鹽酸、三氯乙酸、酒石酸、甲酸、酒石酸、檸檬酸）、提取溫度（30、40、50、60、70、80、95 ℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、提取次數（1、2、3、4）及粉碎度（完整籽粒，20、40、60、80、100目）對青稞黑色素提取率的影響。

1.2.2 二次回歸正交旋轉組合試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇對提取率影響顯著的因子（溫度、時間、乙醇濃度）作為二次回歸正交旋轉組合試驗的因素并確定其零水平和間距。

1.3 色素提取方法

稱取除雜后的青稞種子3 g置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定體積的提取劑，于水浴鍋中回流提取。提取結束后，趁熱過濾，并收集濾液，避光放置待測。

1.4 色素提取率的測定

濾液避光冷卻至室溫后，將pH值調節為2，以提取劑作為空白，于535 nm處測定吸光度，色素的提取率按以下公式計算[13]：

式中：色素提取率，（μg/g）；A535為535 nm 下的吸光度，V為稀釋后的體積，mL；N為稀釋倍數；1000為單位換算倍數（mg/g→μg/g）；98.2為花色素的平均消光系數；m為樣品重量，g。

1.5 數據分析

所有試驗均設置3次重復，單因素試驗數據用spss11.5進行分析，二次回歸正交旋轉組合試驗結果用DPS v8.01軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取劑的選擇

溶劑法提取活性成分時，選擇適宜的溶劑非常關鍵。天然谷物色素屬黃酮類花色苷色素，具有較強極性。因此，在提取時間為 1 h，料液比為 1∶10（g/mL）的室溫條件下，對常用的極性溶劑對黑青稞籽粒中花色苷的提取能力進行測定見圖1。

圖2 乙醇濃度對黑青稞色素提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction yield

結果發現，色素提取率隨乙醇濃度的增加而增加,當乙醇濃度達到60%時提取率最高，隨后又逐漸降低。青稞色素易溶于乙醇，在水中溶解度相對較低，但水起著穿透植物細胞的作用，有助于花色苷從細胞中滲出[14]，因此選用醇-水混合物可提高提取率。根據試驗結果，確定最佳乙醇濃度為60%。

2.1.2 pH值及酸化劑的選擇

花色苷在中性和弱堿性溶液中不太穩定，因此，提取過程通常要采用酸性溶劑。酸性溶劑在破壞植物細胞膜的同時溶解水溶性色素，但過低的pH值能改變色素的原始狀態，為了獲得更接近于天然狀態的花色苷一般可采用有機酸作為酸化劑[15]。此外，根據青稞色素的穩定性研究，其在pH 3時穩定性較好（另文報道），因此試驗選擇在此pH條件下，研究不同酸化劑對提取率的影響。

圖3 不同酸化劑對黑青稞色素提取率的影響Fig.3 Effect of acidifying agent on extraction yield

結果如圖3所示，相同pH值條件下以有機酸為酸化劑時提取率普遍高于鹽酸，其中以檸檬酸提取率最高。該結果與在黑米色素中的研究結果一致[16-17]，可能是由于檸檬酸酸性柔和，不會破壞花色素的結構，對色素無不良影響[18]。因此，確定用檸檬酸為酸化劑。

2.1.3 提取溫度的選擇

提高溫度是增大花色素溶解度和溶出速率的有效途徑，但溫度過高也會加速活性成分的分解，尤其是對黃酮類具有還原活性物質來說不宜用過高的溫度提取。此外過高的溫度在實際生產中會使生產成本增加。因此，選擇合適的提取溫度至關重要，結果見圖4。

圖4 提取溫度對黑青稞色素提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield

如圖4所示，黑青稞提取率在30℃~70℃隨溫度升高呈增加趨勢，而大于80℃后提取率反而有所下降。這是由于溫度過高情況下，色素發生一定程度的降解，同時，溫度較高促進可溶性蛋白質溶出變性，溶液黏度增大影響細胞分裂，阻礙了黃酮類物質的溶出，從而降低了花色素的提取率[19]。綜合考慮，確定最佳提

圖1 提取劑對黑青稞色素提取率的影響Fig.1 Effects of solvent on extraction yield

結果如圖1所示，乙醇-水溶液（70%乙醇）的提取率最高，甲醇-水溶液（70%甲醇）和水溶液次之，純甲醇和乙醇的提取率極低。乙醇安全廉價，提取液黏度小、易過濾、回收方便，不易發霉變質，所以選擇乙醇-水溶液（70%甲醇）作為提取劑。

進一步考察乙醇濃度對提取率的影響見圖2。取溫度為70℃。

2.1.4 提取時間的選擇

以pH 3（檸檬酸）的60%乙醇水溶液為提取劑，提取率隨時間的變化規律如圖5所示。

圖5 提取時間對黑青稞色素提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction yield

在0.5 h～5 h時提取率逐漸增加。天然有機化合物在提取過程中，時間過短難以有效提取，而時間過長有效成分可能被破壞，并且造成成本的浪費。花色苷類物質其本身易被氧化破壞，過長時間提取會導致其受熱降解[19]。因此將時間確定為時間為3 h。

2.1.5 料液比的選擇

料液比的選擇見圖6。

圖6 料液比對黑青稞色素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-solvent ratio on extraction yield

由圖6可知，黑青稞色素提取率隨料液比的增大而升高，但當料液比大于 1∶10（g/mL）后，提取率逐漸下降。這是由于液固兩相存在溶解平衡和吸附平衡，低溫有利于吸附，由于料液比的增大，在產生相同熱量的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強導致提取率下降[20]，同時考慮到從生產效率，耗能和節約成本等各方面因素，確定1∶10（g/mL）應為最佳的料液比。

2.1.6 提取次數的選擇

提取次數的選擇見圖7。

圖7 提取次數對黑青稞色素提取率的影響Fig.7 Effects of extraction frequency on extraction rate

如圖7所示，青稞籽粒在60℃提取1 h時，提取率隨提取次數增加而提高。假定提取4次的色素總量為100%，則1、2、3次提取率分別為85.1%、96.2%、99.7%，差異不顯著（P＞0.05）。因此從節約成本，生產效率等各方面考慮確定進行一次提取。

2.1.7 籽粒粉碎度的選擇

青稞籽粒含有50%以上的淀粉，在溫度較高的條件下發生糊化[21]，造成粉碎籽粒的提取液渾濁黏稠，難以過濾及測定。此外青稞色素主要存在于其種皮之中，因此確定以完整籽粒進行色素提取。

2.2 三元二次回歸正交旋轉組合設計的試驗結果

對單因素試驗結果進行方差分析（ANOVA），發現提取時間、溫度、和乙醇濃度對提取率的影響顯著（p＜0.05），因此以這3個因素作為正交試驗研究對象，固定其它試驗條件為：以酸化劑為檸檬酸，料液比1∶10（g/mL），完整籽粒提取一次。取試驗中效果較好的水平最為各正交試驗研究因素的零水平，并設計因素水平編碼表，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the test

2.2.1 正交試驗設計表及試驗結果

采用DPS軟件編制二次正交旋轉組合設計表，并將試驗結果列入表2。

表2 黑青稞色素的回歸旋轉組合設計表和色素提取率Table 2 Quadratic regression rotational combinational design and extraction yield

續表2 黑青稞色素的回歸旋轉組合設計表和色素提取率Continue table 2 Quadratic regression rotational combinational design and extraction yield

2.2.2 回歸方程的建立和檢驗

利用DPS軟件對試驗結果進行統計分析，得到影響多糖提取率的回歸方程：

式中：Y 為色素提取率（μg/g）；X1為提取溫度，℃；X2為提取時間，h；X3為乙醇濃度，%。

表3 回歸旋轉組合設計試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of quadratic regression rotational combinational design

2.2.3 因素重要性分析

為進一步確定各因素色素提取率的影響程度，采用貢獻率法[22]對二次正交旋轉組合設計結果進行分析。F值的標準轉換值計算公式如下：

貢獻率計算公式如下：

式中：Δj為第j因素對提取效果的貢獻的大小；Δj代表第j因素F值的標準轉換值；Δij代表第i因素與第j因素交互作用F值的標準轉換值;Δjj代表表第j因素二次項F值的標準轉換值。

據表3均方比F值，可知溫度、時間、乙醇濃度對提取率的貢獻率分別為 Δ1=1.1083，Δ2=2.082266，Δ3=2.186386。由于 Δ3＞Δ2＞Δ1，所以各因素對提取率的作用大小依次為乙醇濃度＞時間＞溫度。

2.2.4 提取條件的優化和驗證

優化提取方案中Xi取值頻率分布表見表4。

表4 優化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 4 The probability distribution of Xiin the combined application

表3由方差分析結果可知，回歸方程的失擬性檢驗：F1＞F0.05(5，8)=1.64 不顯著，即所選的回歸模型不存在失擬因子，回歸模型是合適的。對回歸方程進行顯著性檢驗：F2＞F0.05(9，13)=8.27 極顯著，說明得到的回歸方程與試驗數據是吻合的，該數學模型成立。對回歸系數進行顯著性檢驗，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項，得到優化后的回歸方程：

DPS軟件分析可得，黑青稞色素提取率最高時提取方案為X1=-1.682，X2=0，X3=-1，即溫度 53℃，時間 3h，乙醇濃度50%。此時提取率為108.33 μg/g，明顯高于原試驗設計中所有處理組合的提取率。在此條件下對結果進行驗證，實際提取率為 105.27、106.11、105.54 μg/g，與理論值間誤差小于3%，說明該回歸方程與實際情況吻合良好。

本試驗為三因素五水平，共有53=125種組合方式，其中大于88.04的方案有45個，各變量取值的頻率分布如表4所示。在95%的置信區間內提取率大于88.04的優化提取方案為：溫度57.20℃～61.19℃，時間2.528 h～3.189 h，乙醇濃度 51.53%～57.44%。

取優化后浸提條件的平均值方案，X1=-1.0805，X2=-0.1415，X3=-0.5515，即溫度為 59.2 ℃，時間為2.9 h，乙醇濃度為54.5%組合方案對優化結果驗證。此時理論值 Y=103.37 μg/g，與實測值 100.06 μg/g 非常接近（誤差為3.2%），說明該回歸模型可以較好的反映實際規律，也進一步驗證了其合理性。

3 結論

本研究采用經典溶劑提取法提取黑青稞色素，對儀器設備要求不高。在設計試驗時，考慮到眾多因素都對提取效率有著不同程度的影響，因此先進行了單因素試驗，篩選出對提取效率影響顯著的因素，再通過二次正交旋轉組合試驗確定最佳提取工藝，有效提高了試驗的嚴謹性和可靠程度。試驗結論如下：

西藏黑青稞中花色苷類色素提取條件的優化數學回歸模型為：

由回歸方程可知，在酸化劑為檸檬酸（pH 3），料液比1∶10 g/mL，完整籽粒提取一次的條件下，黑青稞花色素最佳提取工藝條件為：53℃，時間3 h，乙醇濃度50%，各因素對提取率的作用大小依次為乙醇濃度＞時間＞溫度。此數學回歸模型在試驗范圍內能較準確的預測總花色素的提取率。

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Extraction Technology of Anthocyanins from Black Hulless Barley

ZHAO Tao,MA Lin,LI Jia-jia,DU Jing-jun,YANG Juan,YANG Fan
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai University of Engineering Sciences，Shanghai 201620，China）

2009-11-07

上海市教委優秀青年教師基金資助項目（B-8500-08-0112）；上海工程技術大學科研啟動基金（校啟08-25）；上海工程技術大學大學生創新活動計劃項目（CS0904003）

趙桃（1982—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分。