柚皮苷和柚皮素在Caco-2細胞模型的吸收研究

易少凌

廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520

柚皮苷和柚皮素在Caco-2細胞模型的吸收研究

易少凌

廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520

目的：研究柚皮苷(Naringin)和柚皮素（Naringenin）在Caco-2細胞模型中的吸收特性。方法：用Caco-2細胞單層模型研究柚皮苷和柚皮素的雙向轉運，并考察柚皮苷和柚皮素隨時間吸收的變化。用高效液相色譜法檢測藥物濃度，計算其表觀滲透系數。結果：柚皮苷（50μM）、柚皮素（50μM）雙向轉運的濃度均隨著時間增加而增加，柚皮苷的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數（Papp）均小于1.0×10-6cm.s-1，Papp(B-A)/Papp(A-B)約為0.4；柚皮素的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數（Papp）均位于1.0×10-6cm.s-1～10×10-6cm.s-1之間， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為2.0。結論：柚皮苷屬于吸收不良的藥物，而柚皮素屬于吸收中等偏差水平；柚皮素比柚皮苷更易被吸收，該藥物的吸收情況與是否存在糖基有關；柚皮苷被小腸頂側膜的轉運載體所攝取，而柚皮素的吸收則兼有外排作用。

柚皮苷；柚皮素；Caco-2細胞模型；雙向轉運

柚皮苷（Naringin）又稱柚苷、柑橘苷、異橙皮苷，主要存在與蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，柚皮苷也是中草藥骨碎補、枳實、枳殼、橘紅的主要有效成分。各種植物中柚皮苷含量隨品種、產地的不同而有較大差別，通常未成熟的果含量更高。柚皮素是柚皮苷的苷元。它們均具有抑制P450酶、抗炎、抗腫瘤、利膽、抗氧化等作用。

據文獻報道，兔灌胃研究柚皮素的絕對生物利用度為4%～8%，但吸收機制不清楚。本實驗旨在運用Caco-2細胞模型研究柚皮苷和柚皮素的吸收。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器、設備

柚皮苷Naringin（Product of USA，含量95%）；柚皮素Naringenin（Product of United Kindon，95%）；橙皮素Hesperetin（Product of United Kindon，含量95%）。

DMEM培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，GIBCO）；胎牛血清（Fetal bovine serum，杭州四季清）；非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA，GIBCO）；胰蛋白酶（Trypsin，上海生工）；β-Glucuronidase（product of England）；MTT（四甲基偶氮唑鹽，5mg/ml溶于PBS）；HBSS(Hank’s balanced salt solution，PH7.2～7.4）（含有16g/L的NaCl、0.04g/L的KCl、0.20g/ L的MgSO4·7H2O、0.134g/L的KH2PO4·14H2O、0.35g/L的NaHCO3、2.38g/L的HEPES、0.14g/L的CaCl2、1.0g/L的D-葡萄糖，用NaHCO3調PH值，均為分析純）；二甲基亞砜、甲醇、乙腈、丙酮（均為色譜純）；NaH2PO4(北京益利精細化學品有限公司，分析純，GB1267-77)；磷酸（廣州化學試劑廠，分析純，20000101-3）。

Caco-2細胞（ATCC(American Type Culture Collection，USA））；12孔Transwell（Corning Costar，Cambridge，MA，USA）；培養箱（Heraeus，德國）。

1.2 細胞培養

Caco-2細胞在37℃，含5%的CO2環境中培養，用DMEM培養液。培養液中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、2.38g/L的HEPES以及100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素雙抗液。當細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA液消化細胞，按1∶3傳代培養，每兩天換一次培養液。

1.3 細胞毒性實驗

MTT實驗是一種通過檢測活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活性反映細胞活力的方法。上述培養的Caco-2細胞以1×104/孔接種于96孔培養板，于37℃，含5%的CO2環境中孵化36小時后去除培養基，分別加入含有不同濃度的柚皮苷、柚皮素的HBSS溶液200μl（含＜1%的DMSO），每個濃度3孔，空白3孔。在培養箱中孵化3小時后結束，吸出藥液，加入20μl含5mg/L MTT的PBS溶液繼續孵育4小時后，去除MTT，每孔加入200μl DMSO溶解紫色結晶產物。用酶聯免疫檢測儀在590nm比色測定，以A藥液/A空白-濃度繪圖。

1.4 細胞模型轉運試驗

1.4.1 細胞模型的建立

上述培養的Caco-2細胞接種在12孔Transwell板上，接種密度為2×105/孔，內層加培養液0.5ml、外層加培養液1.5ml，第1周隔天換液，后2周每天換液，待生長至21天左右，細胞形成緊密的單層，可用于實驗。

1.4.2 細胞單層完整性驗證

在每種藥物的轉運實驗進行前及結束后，均用EVOM(Epithelial voltammeter，WPI，Sarasota，FL，USA)測定在pH值為7.2～7.4時的跨上皮細胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER），確定單層細胞的緊密性與完整性。

1.4.3 雙向轉運試驗

運用柚皮苷和柚皮素的跨膜通透率作為檢測其轉運情況的標準。在pH值為7.2～7.4的情況下，進行柚皮苷和柚皮素從Caco-2細胞單層頂端（A面）→基底端（B面） 以及基底端（B面）→頂端（A面）的轉運實驗。實驗前，細胞用HBSS(pH7.2～7.4)液小心沖洗3次，最后1次在37℃培養箱中孵育0.5h。頂端（A面）→基底端（B面）：在A面分別加0.5ml的柚皮苷（29μg/ml，50μM）或柚皮素（13.6μg/ml，50μM）；B面加1.5ml的HBSS液。基底端（B面）→頂端（A面）：在B面分別加1.5ml的柚皮苷（29μg/ml，50μM）或柚皮素（13.6μg/ml，50μM）；A面加0.5ml的HBSS液。放入培養箱37℃孵育，分別于30min、60min、90min、120min從B面或者A面取樣檢測。

1.5 樣品濃度測定

1.5.1 測定前處理

200μl樣品，其中80μl直接進樣，120μl經酶水解后進樣。處理方法如下：取樣品100μl于離心管中，加10μl 10μg/ ml的內標（橙皮苷），加5 000U/ml的酶50μl，于37℃中水解4h，加10μl pH4.55HAc，渦旋30s，加300μl丙酮，渦旋1min，10 800rpm，離心10min，取上清液，氮氣吹干，加150μl CH3OH : pH2.55磷酸緩沖液（1:1），渦旋30s，10 800r/s，離心5min，取上清液，進樣100μl。

1.5.2 分析方法及條件

柚皮苷和柚皮素均使用HPLC測定濃度。Waters高效液相色譜系統：Waters 600 Controller、Waters 717 plus自動進樣器、Waters 486紫外檢測器、Waters Millennium 32色譜數據處理軟件；色譜柱（Thermo, Part No. 28 105-254 630）。流動相：甲醇（A）：PH2.55NaH2PO4(B)：乙腈（C），梯度洗脫，從0min～18min，A從45%～13%，B從55%～37%，C從0%～50%；從18min～20min，A從13%～45%，B從37%～55%，C從50%～0%，然后以這個比例平衡10min。

1.6 表觀滲透系數

根據下式計算得藥物的表觀滲透系數Papp（apparent permeability coefficients ）： Papp= (dQ/dt )/(A×C0)。其中：C0是藥物所在端（donor）的初始濃度，dQ為藥物在dt時間段內在接受端（receiver）透過量， A是Transwell多聚碳酸酯膜的表面積。

2 結果

2.1 藥物含量測定

2.1.1 專屬性

專屬性實驗顯示柚皮苷、柚皮素和橙皮苷出峰處，均未出現干擾峰，且在該條件下柚皮苷、柚皮素和橙皮苷完全分離（圖1）。

圖1 Naringin、Naringenin 的HPLC圖譜

2.1.2 未水解樣品的標準曲線制備及精密度考察

制備濃度梯度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5g ·L-1的柚皮苷與柚皮素的HBSS溶液1ml作為標準曲線樣品。直接進樣50μl分析，以已知濃度為橫坐標，所得峰面積為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程。柚皮苷的標準曲線為 y = 79568x+760.05，R2=0.9999，Nringenin的標準曲線為y = 180748x+1120.2，R2=1，該法線性好，線性范圍均為0.01μg · ml-1～5.0μg· ml-1；絕對回收率大于70%；高(5μg· ml-1)、中(0.25μg· ml-1)、低(0.025μg· ml-1)3個濃度的日內、日間精密度均小于10%。符合生物樣品分析的一般要求。

2.1.3 已水解樣品的標準曲線制備及精密度考察

制備濃度梯度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5 g ·L-1的柚皮苷和柚皮素 的HBSS溶液1ml作為標準曲線樣品。依（樣品處理）的方法將標準曲線樣品經酶水解后進樣100μl分析，以已知濃度為橫坐標，所得藥物峰面積與內標峰面的比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程。柚皮苷的標準曲線為 y =0.4548x+0.0103，R2=0.9998，Nringenin的標準曲線為y =1.1638x+0.0381，R2=0.9998，該法線性好，線性范圍均為0.01μg· ml-1～5.0μg· ml-1；絕對回收率大于75%；高(5μg· ml-1)、中(0.25μg· ml-1)、低(0.025μg· ml-1)3個濃度的日內、日間精密度均小于10%。符合生物樣品分析的一般要求。

2.2 Caco-2細胞毒性實驗

當藥物濃度對細胞無毒時，A藥液/A空白＞=1。細胞毒性實驗顯示，柚皮苷濃度 ＜30μg/ml時，A藥液/A空白＞=1；柚皮素濃度＜15μg/ml時，A藥液/A空白＞=1。該結果說明在實驗濃度下藥物對Caco-2細胞無毒性。

2.3 單層細胞完整性的驗證

在進行柚皮苷和柚皮素的Caco-2細胞轉運實驗之前，測定了單層細胞的胯膜電阻（TEER）以驗證細胞膜的完整性，其TEER的值大于200Ω·cm2（在200Ω·cm2～500Ω·cm2之間），該細胞模型完整性在要求范圍內，可用于進行雙向轉運實驗。

2.4 柚皮苷、柚皮素雙向轉運實驗

Caco-2細胞模型對柚皮苷和柚皮素的雙向轉運實驗結果顯示，柚皮苷（50μM）、柚皮素（50μM）雙向轉運的濃度均隨著時間增加而增加，并在120min內呈線性增加趨勢，其線性回歸相關系數達0.9以上（圖2），未出現飽和現象。Caco-2細胞模型對柚皮素的雙向轉運實驗中，樣品未經水解直接HPLC測定的圖譜中發現了柚皮苷峰，且其濃度隨著柚皮素吸收的增加而增加。柚皮苷的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數（Papp）均小于1.0×10-6cm·s-1， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為0.4；柚皮素的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數（Papp）均位于1.0×10-6cm ·s-1～10×10-6cm·s-1 之間， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為2.0(表1，表2)。

表1 柚皮苷、柚皮素的Papp值(未水解)，mean±SD，n=3

表2 柚皮苷、柚皮素的Papp值(已水解)，mean±SD，n=3

3 討論

Caco-2細胞來源于人類結腸癌細胞，其結構和生化特點類似于人類小腸上皮細胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶，能夠在細胞水平提供關于藥物分子通過小腸粘膜的吸收、代謝、轉運信息。該模型操作簡便，重現性好，可評價不同實驗條件下藥物的跨膜轉運速率。

Caco-2細胞模型中，通常用Papp來評價藥物在腸道的吸收情況，Fêger等和Artursson 等用Caco-2細胞模型研究了多種不同結構藥物的轉運機制，發現Papp值為5×10-8cm·s-1～5×10-5cm·s-1。經過與體內結果進行比較發現，吸收為1%～100%的藥物，其Papp為（0.1～10） ×10-6cm·s-1；而吸收差的藥物（即吸收＜ 1% ）的Papp＜ 10-7cm·s-1。因此，根據實驗結果，柚皮苷屬于吸收不良的藥物，柚皮素比柚皮苷更易被吸收，柚皮素屬于吸收中等偏差水平，這與動物實驗結果相符（柚皮素兔灌胃的絕對生物利用度為4%～8%）。

理論認為，Papp（A→B）與Papp（B→A）接近時，化合物以被動擴散方式轉運； Papp（A→B） 明顯大于Papp（B→A）時，化合物被小腸頂側膜的轉運載體所攝取；Papp（B→A）明顯大于Papp（A→B）時，化合物被小腸頂側膜的轉運蛋白外排。雙向轉運實驗結果表明，柚皮苷Papp（B→A） /Papp（A→B）約為0.4，說明柚皮苷被小腸頂側膜的轉運載體所攝取；而柚皮素Papp（B→A）/ Papp（A→B）約為2.0，提示其在小腸吸收轉運過程中受到外排性轉運蛋白的影響。

在柚皮素的轉運實驗中，發現了柚皮苷峰，且隨著柚皮素吸收的增加而增加，這可能是因為柚皮素通過細胞時在酶的催化下發生了第Ⅱ相反應（即結合反應）的葡萄糖醛酸反應，但需要更進一步的實驗驗證。

綜上所述，柚皮苷屬于吸收不良的藥物，柚皮素屬于吸收中等偏差水平；柚皮素比柚皮苷更易被吸收，該藥物的吸收情況與是否存在糖基有關；柚皮苷被小腸頂側膜的轉運載體所攝取，柚皮素的吸收兼有外排作用；柚皮素通過細胞時可能在酶的催化下發生了第Ⅱ相反應（即結合反應）的葡萄糖醛酸反應，但需要更進一步的實驗驗證。本實驗對研究兩種藥物在人體中的生物利用度和吸收機制均具有一定的參考作用。

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1674-6708（2010）24-0131-03