兩步法制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的工藝參數研究

李亞云，趙新淮*

(東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

兩步法制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的工藝參數研究

李亞云，趙新淮*

(東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了制備高活性ACE抑制肽，研究兩步法高活性酪蛋白ACE抑制肽的制備工藝條件參數。利用枯草桿菌堿性蛋白酶55℃水解酪蛋白6h制備酪蛋白ACE抑制肽，IC50為38.6μg/mL；采用相同的酶進行Plastein反應來修飾酪蛋白ACE抑制肽，并應用響應面分析法優化修飾反應條件。固定酪蛋白ACE抑制肽質量分數為35%，以ACE抑制肽的游離氨基減少量為指標，優化的修飾反應條件為酶添加量7.7kU/g蛋白質、溫度42.7℃、反應時間6h，在此條件下，酪蛋白ACE抑制肽的游離氨基減少量達到179.72μmol/g蛋白質。ACE抑制活性分析結果表明，修飾后ACE抑制肽的抑制活性顯著提高且與修飾反應程度相關，IC50可降至0.5μg/mL。

酪蛋白；ACE抑制肽；制備工藝；Plastein反應

Abstract：The ACE inhibitory peptides derived from casein hydrolyzed with alkaline protease from Bacillus subtilis at 55 ℃for 6 h exhibited an IC50of 38.6μg/mL. To enhance their activity, they were modified via the plastein reaction catalyzed by the enzyme. Moreover, response surface methodology was employed to investigate the optimal values of plastein reaction parameters including enzyme dosage and reaction temperature and time. Results showed that after the optimal reaction for 6 h at 42.7 ℃and an enzyme dosage of 7.7 kU/g protein, the content of free amino groups in the peptides were decreased by up to 179.72 μmol/g protein. The optimized plastein reaction resulted in an obvious enhancement of casein-derived ACE inhibitory peptides, which was related to the reaction degree and the IC50of the modified ACE inhibitory peptides was reduced to 0.5μg/mL.

Key words：casein；ACE inhibitory peptides；preparation method；plastein reaction

蛋白質經蛋白酶水解后，產生分子質量不等的肽類，這些肽類的功能性質尤其是生物活性可能發生顯著變化[1-2]。酪蛋白作為主要的食品蛋白質來源之一，是制備生物活性肽的重要原料[3-4]，可以制備ACE抑制肽、抗氧化肽等。血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽以其安全性等優點具有研究和實用價值[5]。目前，國內外對ACE抑制肽的制備研究，主要集中在蛋白酶和蛋白質的選擇[6-7]、酶解條件和相關制備參數的優化[8-9]等方面。這些研究的特征是，在從蛋白質底物制備ACE抑制肽時無論是利用單一蛋白酶或復合蛋白酶的催化作用，均為一步法酶水解或者是連續酶水解的過程。因此，此類方式的制備技術必然導致ACE抑制肽的氨基酸序列結構受限制于原料蛋白質的一級結構，即ACE抑制肽的活性高低受限制于蛋白質底物。故此，采用修飾技術手段來提高蛋白質水解物的ACE抑制活性，制備高活性的ACE抑制肽，是一個令人十分感興趣的技術問題，甚至可能涉及新的理論問題。

Plastein反應是濃縮的蛋白水解物在合適條件下經蛋白酶作用形成凝膠狀物質的反應，它通常被認為是蛋白質水解反應的逆反應[10]。Plastein反應過去常被用于改善蛋白質氨基酸組成[11]，提高蛋白質功能性質[12]等方面。Plastein反應所涉及的機理復雜，至少存在3種不同理論[13-15]；縮合作用、轉肽作用、物理聚集。Plastein 反應中的轉肽作用和縮合作用涉及在肽分子之間有新肽鍵的生成，而縮合作用還涉及到反應底物中游離氨基的減少。所以，蛋白質水解物在進行Plastein反應時，底物游離氨基減少量可以反映Plastein反應的程度。由于Plastein 反應中的轉肽作用和縮合作用涉及新肽鍵的生成，這就意味著蛋白質水解物通過Plastein反應修飾后，有可能生成在原料蛋白質中不存在的某些新肽段，從而影響到最終產物的ACE抑制活性。目前尚未發現有其他的研究者利用Plastein反應來制備ACE抑制肽的相關報道。為此，本研究嘗試兩步法制備酪蛋白ACE抑制肽。首先，利用堿性蛋白酶水解酪蛋白獲得一定活性大小ACE抑制肽，然后應用堿性蛋白酶催化的Plastein反應對ACE抑制肽進行第二步修飾；以反應底物(ACE抑制肽)游離氨基減少量為指標，重點地應用響應面分析法對修飾反應進行優化，建立相應的數學模型；最后對一些修飾產物的ACE抑制活性進行評價、比較。研究結果可以確定Plastein反應修飾制備高活性ACE抑制肽的可行性，以及兩步法的技術路線參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(蛋白質含量95.7%) 上海山浦化工有限公司；堿性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；FAPGG(FA-Phe-Gly-Gly)；兔肺丙酮粉 Sigma公司；卡托普利(Captopril) Fluca公司；其他所用試劑均為分析純試劑，所用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

UV-2401PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DELTA 320精密pH計 梅特勒-托利多中國有限公司；KjeltecTM2300全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；G1-21M冷凍離心機 上海市離心機械研究所；LGJ-1真空冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公；H-1微型漩渦混合器 上海精科實業有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

圖1 高活性酪蛋白ACE抑制肽的制備工藝流程Fig.1 Production flow chart of casein-derived ACE inhibitory peptides with high activity

1.3.2 ACE抑制肽的制備

將酪蛋白配制成質量分數10%溶液并用2mol/L的NaOH溶液調節pH8.5，加入堿性蛋白酶(10kU/g蛋白質)，55℃下水浴中水解6h；95℃條件下滅酶處理15min，冷卻至室溫后5000r/min離心20min以除去不溶性沉淀。測定上清液(酪蛋白水解物)的蛋白質含量和游離氨基含量，計算水解度。取1mL上清液，一定倍數稀釋后測定其ACE抑制活性。上清液冷凍干燥后得到酪蛋白ACE抑制肽，并保存于－20℃待后續研究。

1.3.3 ACE抑制肽的Plastein修飾反應優化

用堿性蛋白酶催化Plastein反應，固定底物(酪蛋白ACE抑制肽)質量分數為35%，研究3個因素(堿性蛋白酶添加量、反應溫度、反應時間)對修飾反應的影響行為，以反應底物的游離氨基減少量為響應值，根據中心組合試驗設計原理，采用三因素五水平響應面分析方法，其因素水平編碼見表1。

表1 響應面分析的因素水平編碼表Table 1 Variable and levels in central composite design

1.4 相關分析

1.4.1 蛋白質含量、水解度以及酶活力的測定

蛋白質含量：按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》[16]測定。

游離氨基含量與蛋白質水解度(DH)測定：采用鄰苯二甲醛(OPA)法[17-18]。

OPA試劑的配制：準確稱取2.00g 十二烷基磺酸鈉(SDS)，加入30mL pH9.5的硼酸緩沖液，水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1mL 80mg/mL的OPA乙醇溶液和200μL β-巰基乙醇，最后用硼酸緩沖液定容至100mL。此溶液現用現配。

樣品溶液稀釋1000倍后，取3mL樣品稀釋液或標準溶液與同體積的OPA試劑混合并開始計時，準確計時5min，立即在分光光度計上測定，波長為340nm。以亮氨酸溶液(12～36μg/mL)為標準溶液繪制標準曲線，利用標準曲線計算樣品中游離氨基的濃度(μmol/mL)。水解度計算公式[19]如下：

酶活力測定：采用SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[20]測定。

1.4.2 ACE抑制活性測定[21]

ACE酶液：50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預冷至4℃的硼酸緩沖液(pH8.3，100mmol/L)中，4℃保持12h后于20000r/min冷凍離心40min，收集上清液并4℃保存。

FAPGG底物溶液：將FAPGG溶于pH8.3 100mmol/L的硼酸緩沖液(含300mmol/L NaCl)，配制成1.6mmol/L的溶液。

500μL FAPGG底物溶液與100μL超純水或抑制劑(ACE抑制肽或卡托普利)混勻，37℃預熱2min，加入300μL ACE酶液開始反應，在37℃反應30min后，立即加入100μL EDTA(100mmol/L)終止反應，加入4mL超純水稀釋，平行3次。0min樣品的測定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。340nm處分別測體系在0min和30min時的吸光度，計算差值ΔA(ΔA=A0min－A30min)。以單位時間內吸光度的變化表示ACE酶活力，抑制劑對ACE的抑制程度應用下式計算[6]：

式中ΔAc為加入超純水時吸光度在30min內的變化；ΔAi為加入抑制劑時吸光度在30min內的變化。

IC50定義為抑制50% ACE酶活力時所需抑制劑的濃度，通過下式將ACE抑制活性轉換成IC50[6]：

式中：IC為測定過程中抑制劑濃度/(mg/mL或nmol/L)；v為加入抑制劑后測得的相應酶活力/%(v=100－ACE抑制活性)。本研究中卡托普利的IC50測定值為5.2nmol/L。

1.5 統計分析

用Design Expert 7.0軟件中Response Surface程序進行分析，用Model Graphs程序作響應曲面圖和等高線圖。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白ACE抑制肽的制備

大多數ACE抑制肽是由2～12個氨基酸殘基組成的小肽[2]，這需要酪蛋白的深度水解才能達到。利用前期研究所選定的水解條件，堿性蛋白酶水解酪蛋白6h，獲得ACE抑制活性較強的酪蛋白水解物。測定結果顯示，其IC50為38.6μg/mL(表4)。通過測定、計算，酪蛋白水解物的DH為11.2%。以后就以此水解物(酪蛋白ACE抑制肽)作為底物，研究第二步Plastein修飾反應的適宜條件參數，以及修飾反應對它的ACE抑制活性的影響作用。

2.2 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反應條件優化

2.2.1 回歸方程的建立與分析

表2 中心組合試驗設計及結果Table 2 Central composite design matrix and experimental results of decrease of free amino groups in casein-derived ACE inhibitory peptides before and after modification

前期研究發現，Plastein反應修飾時，底物濃度過大則體系的黏度太大而不利于反應；底物濃度過低則導致發生水解反應；適宜的底物濃度為35%(m/m)[22]。為了確定其他的適宜條件參數，按照中心組合設計的統計學要求，進行20組試驗，以Plastein反應過程中底物游離氨基減少量(底物反應前的游離氨基含量減去反應后產物的游離氨基含量)為響應值Y，試驗設計和結果見表2。

利用Design-Expert軟件對表2中的數據進行二次多項回歸擬合，剔除不顯著的因子，獲得底物游離氨基減少量(Y)與酶添加量(X1)、反應溫度(X2)和反應時間(X3)關系的二次多項式回歸方程為：

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3分析結果看出，所得模型顯著(P＜0.0001)，失擬檢驗不顯著(P=0.2353)，模型與實際情況擬合較好(R2Adj= 0.9803)，可以很好地反映反應過程中底物游離氨基減少量的變化，用于實際反應情況預測。分析還表明，各因素對底物游離氨基減少量的影響順序為反應溫度＞反應時間＞酶添加量。通過回歸方程所作的響應面曲面圖及其等高線圖，如圖2～4所示。

酶添加量和反應溫度對產物的游離氨基減少量交互作用的響應面及等高線圖見圖2。二者之間的交互作用較小，當酶添加量一定時，所選反應溫度范圍內產物的游離氨基減少量隨反應溫度的升高而增加，這一現象與反應溫度升高能提高反應速率以及堿性蛋白酶的最適催化溫度有關。另外，當反應溫度一定時，產物的游離氨基減少量先逐漸增加后逐漸降低。從等高線圖中可以看出，當反應時間為5h時(0水平)，酶添加量為6.8～8.5kU/g蛋白質、反應溫度為28～42℃時，產物的游離氨基減少量較大。

酶添加量和反應時間交互作用的響應面和等高線見圖3。二者之間的交互作用較大，隨著反應時間延長、酶添加量的增加，產物的游離氨基減少量先逐漸增加，然后逐漸減少。從等高線圖中可見，當反應溫度為30℃時(0水平)，酶添加量為6.7～8.5kU/g蛋白質、反應時間為4.7～7.7h時，產物的游離氨基減少量較大。

反應溫度和時間交互作用的響應面和等高線見圖4。從等高線圖中可見，當酶添加量為7.5kU/g蛋白質時(0水平)，反應溫度為30～42℃、反應時間為3.7～7.7h時產物的游離氨基減少量較大。在所選的反應溫度和時間范圍內，反應溫度和時間對產物的游離氨基減少量的單獨作用都非常顯著，但是它們的交互作用不顯著，這可能是由于在所選的反應溫度范圍內，升高溫度對反應速率的影響最大。

對回歸模型進行數學分析，計算得到極大響應值和對應的因素條件為：酶添加量(X1)為7.7kU/g蛋白質、反應溫度(X2)42.7℃、反應時間(X3)為6h，產物的游離氨基減少量(Y)為185.66μmol/g蛋白質。

2.2.2 Plastein反應條件的驗證實驗

采用上述優化得到的Plastein反應條件進行實際反應，測得產物的游離氨基減少量為179.72μmol/g蛋白質(3次結果的平均值)，與理論值(185.66μmol/g蛋白質)相比無顯著差別，說明響應面法優化得到的工藝條件參數準確可靠。

2.3 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反應修飾與抑制活性變化

對先前制備出的酪蛋白ACE抑制肽進行Plastein反應修飾，通過改變反應時間，制備出修飾反應程度不同(游離氨基減少量不同)的3個產物，它們的ACE抑制活性(3次平均值)和IC50值列于表4。在相同的最終濃度下(0.01mg/mL)，修飾反應前的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性為20.59%，相應的IC50為38.6μg/mL；經過Plastein反應修飾后，產物的ACE抑制活性發生顯著變化。當產物的游離氨基減少量為83.59μmol/g蛋白質，其ACE抑制活性為22.06%，相應的IC50降低至35.3μg/mL，相比底物差異不大；當產物的游離氨基減少量為129.57 μmol/g蛋白質(即進一步減少了約46μmol/g蛋白質)，其ACE抑制活性為42.65%，相應的IC50降低至13.4μg/mL，與底物相比差異很大；當產物的游離氨基減少量為179.72μmol/g蛋白質(即再一次減少了約50μmol/g蛋白質)，其ACE抑制活性達到95.59%，相應的IC50降低至0.5μg/mL，與底物相比差異極大。表4中的分析數據表明，Plastein反應修飾處理確實提高了酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性，并且Plastein修飾反應程度越大，酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性越高，顯示出與修飾反應程度(產物的游離氨基減少量)之間存在一定的關聯性，但是相關的分子機制有待于今后的研究來揭示。無論如何，研究結果亦表明利用兩步法、采用Plastein反應修飾制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的可行性。

表4 Plastein反應修飾對酪蛋白ACE抑制肽活性的影響Table 4 Influences of plastein modification on ACE inhibitory activity of casein hydrolysates

3 結 論

采用兩步法可以從酪蛋白制備出高活性的酪蛋白ACE抑制肽。首先用堿性蛋白酶在55℃條件下酶解10%(m/m)酪蛋白溶液6h，分離后制備出水解度為11.2%、抑制活性為20.59%、IC50為38.6μg/mL的酪蛋白ACE抑制肽；然后，利用Plastein反應對ACE抑制肽進行修飾，最終得到的ACE抑制肽的ACE抑制活性顯著提高，活性達到95.59%，IC50值降低至0.5μg/mL。

應用響應面分析法建立了Plastein修飾反應的數學模型，得到的優化反應條件為：酪蛋白ACE抑制肽質量分數固定在35%時，酶添加量7.7kU/g蛋白質、反應溫度42.7℃、反應時間6h，此條件下酪蛋白ACE抑制肽的游離氨基減少量約為179.72μmol/g蛋白質。

修飾后的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性與Plastein反應程度存在一定的關聯性，此問題有待于進一步研究。

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Two-step Alkalinase Hydrolysis for Production of Casein-derived ACE Inhibitory Peptides with High Activity

LI Ya-yun，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)10-0006-06

2009-08-20

國家“863”計劃項目(2006AA10Z324)；國家自然科學基金項目(30972132)

李亞云(1982—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：cloud125531@yahoo.com.cn

*通信作者：趙新淮(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn