花生分離蛋白磷酸化改性研究

熊 柳，孫高飛，王建化，孫慶杰,*

(1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.國家花生加工技術研發分中心，山東 青島 266109；3.青島東生集團股份有限公司，山東 萊西 266600；4.青島農業大學海都學院，山東 萊陽 265200)

花生分離蛋白磷酸化改性研究

熊 柳1,2，孫高飛2,3，王建化2,4，孫慶杰1,2,*

(1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.國家花生加工技術研發分中心，山東 青島 266109；3.青島東生集團股份有限公司，山東 萊西 266600；4.青島農業大學海都學院，山東 萊陽 265200)

采用響應面優化法對花生分離蛋白進行磷酸化改性，以氮溶解指數(NSI)為指標得出花生分離蛋白磷酸化改性的最佳條件為三聚磷酸鈉添加量7.77%、花生分離蛋白質量分數6.38%、反應溫度44.85℃、反應體系pH8.24、反應時間5.68h。得到的花生改性蛋白NSI最大值為77.74%。改性后，花生分離蛋白的吸油性、吸水性、持水性、乳化性、乳化穩定性、泡沫穩定性都有不同程度的提高。

花生分離蛋白；磷酸化；改性

Abstract：Peanut protein isolate (PPI) was phosphorylated with sodium tripolyphosphate (STP) for the modification of its functionality. To maximize the nitrogen soluble index (NSI) of PPI, crucial phosphorylation reaction parameters including PPI concentration, STP amount, reaction temperature and time and pH were optimized using response surface methodology (RSM)combined with central composite design based on single factor design. Results showed that the optimal values of the above parameters were as follows: PPI concentration 6.38%, STP amount 7.77% (g/g protein), pH 8.24 and reaction temperature 44.85℃ for a reaction duration of 5.68 h. Under such conditions, a maximum NSI of PPI of 77.74% was obtained. The oil absorption, water absorption, water capacity, emulsifying capacity, emulsion stability, foam stability of PPI were all improved to different extent after the optimized phosphorylation.

Key words：peanut protein isolate；phosphorylation；modification

我國是花生生產大國，花生年總產量居世界首位[1]。花生是重要的食用植物油和蛋白質資源，在植物蛋白資源中居第3位，占世界植物蛋白年產量的11%[2]。隨著世界性蛋白質的短缺，花生將成為人類蛋白質的主要來源之一。由于蛋白具有良好的加工功能性如乳化性、乳化穩定性、起泡性、凝膠性、水溶性等，而被廣泛應用于食品加工業[3]。研究花生蛋白發現，脫脂花生蛋白粉的起泡性、吸油性、泡沫穩定性優于大豆蛋白粉，其余指標低于大豆蛋白粉，因而限制了花生蛋白粉在食品中的應用。因此，一方面開發研究專用功能性和營養特性的系列化高純度功能性花生蛋白，可以彌補花生蛋白功能性的欠缺，另一方面可以進一步拓寬花生蛋白的應用領域。

蛋白質磷酸化已經被認為是提高蛋白功能性的有效手段。早在1941年，Sung等[4]曾用環狀磷酸三鈉磷酸化大豆蛋白，在pH11.5、35℃、1%環狀磷酸三鈉條件下，大豆蛋白中30%的絲氨酸殘基被磷酸化。Matheis[5]使用多聚磷酸鈉在堿性條件下對大豆蛋白進行了磷酸化。Frank等[6]用多種試劑對植物蛋白進行磷酸化，發現三氯氧磷能很大程度地提高蛋白質的經濟和實用價值。Hirotsuka等[7]用三氯氧磷改性大豆蛋白以改善其功能特性。李瑜等[8]采用多聚磷酸鈉對小麥面筋蛋白進行磷酸化。

本實驗通過花生磷酸化對花生蛋白進行改性，改性后花生蛋白在食品工業中有較好的應用前景，尤其是在蛋白飲料工業中應用。且多聚磷酸鈉早已作為食品添加劑應用于食品如肉制品工業中，從食品安全的觀點來看，采用多聚磷酸鈉對花生分離蛋白進行改性，是安全可行的[9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花生分離蛋白(peanat protein isolated，PPI) 自制。

三聚磷酸鈉(STP)、硫酸銅、高氯酸、硝酸、鉬酸銨、對苯二酚 天津巴斯夫化工有限公司；硫酸鉀、濃硫酸(95%)、氫氧化鈉、硫酸、亞硫酸鈉 萊陽康德化工有限公司。

SPM-10 型pH 計、快速水分測定儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；低速大容量離心機、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；懸臂式攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；電熱恒溫水浴鍋、凱式定氮裝置 龍口市先科儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 花生分離蛋白的制備

稱取一定數量的脫脂花生蛋白粉，加入適量的稀堿液，浸提一定時間，經離心分離除去不溶物，上清液用鹽酸調至等電點，離心分離后水洗兩次，干燥、粉碎得到花生分離蛋白。

1.2.2 花生分離蛋白三聚磷酸鈉(STP)改性

單因素試驗基本條件：用蒸餾水把花生分離蛋白配成體積分數為7%的懸浮液，調pH8.0，添加7% STP，在40℃條件下反應，中速攪拌4h，然后調pH值至等電點，2000r/min離心15min，取沉淀部分調pH值至中性，水洗兩遍，干燥、粉碎、過80目篩備用。

1.2.3 響應面設計

綜合單因素試驗結果，選擇花生分離蛋白質量分數(X1)、STP添加量(X2)、反應pH值(X3)、反應溫度(X4)、反應時間(X5)5個因素進行兩水平設計。試驗水平基本根據原配方向兩邊擴充，響應面設計因素水平見表1。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Variables and levels in central composite design

1.2.4 氮溶解指數(nitrogen solution index，NSI)的測定

參考GB/T 5511—1985《糧食、油料檢驗：粗蛋白質測定法》進行。

1.2.5 花生蛋白功能性測定

1.2.5.1 吸油性測定[10]

準確稱取0.5g蛋白產品于10mL離心管中，加入3mL花生油，用玻璃棒攪拌1min后，靜止放置30min，用1000r/min的速度離心25min，記下游離油的體積。

1.2.5.2 保水性測定[10]

向10g干試樣中加入100mL熱水，攪拌均勻，放置20min使之充分吸水，用1000r/min離心5min，去除分離水，測定殘留物的質量。

1.2.5.3 吸水性[10]

準確稱取0.5g樣品加4mL水，用玻璃棒攪拌1min后，40℃水浴中放置30min，用500r/min離心25min，記下游離水的體積。

1.2.5.4 乳化性[11]

稱取3g樣品溶于50mL蒸餾水中，調節pH7.0，加入50mL花生油，在高速組織搗碎機中均質(1000～1200 r/min)2min，再1500r/min離心5min，計算乳化性。

1.2.5.5 乳化穩定性[11]

稱取3g樣品溶于50mL蒸餾水中，調節pH7.0，加入50mL花生油，在高速組織搗碎機中均質(10000～12000r/min)2min，置于50℃水浴中30min后，測出此時的乳化層高度，則乳化穩定性為：

1.2.5.6 起泡性與泡沫穩定性[12]

3g樣品溶解于100mL蒸餾水中，調節pH7.0，然后在高速組織搗碎機中1000～1200r/min均質2min，記錄下均質停止時泡沫的體積及30min后泡沫的體積。

2 結果與分析

2.1 花生分離蛋白磷酸化改性對氮溶解指數NSI的影響

2.1.1 花生分離蛋白質量分數對改性效果的影響

圖1 花生分離蛋白質量分數對NSI的影響Fig.1 Effect of PPI concentration on post-phosphorylation NSI of PPI

由圖1可以看出，改性后蛋白的NSI隨花生分離蛋白質量分數增大先增大后減小，當花生分離蛋白質量分數達到7%時，改性后蛋白的NSI達到最大，因此選擇花生分離蛋白質量分數為7%。

2.1.2 STP添加量對改性效果的影響

圖2 STP添加量對NSI的影響Fig.2 Effect of STP amount on post-phosphorylation NSI of PPI

由圖2可以看出，改性后蛋白的NSI隨STP添加量增加先增大后減小，當STP添加量達到7g/100g蛋白時，改性后蛋白的NSI達到最大，因此選擇STP添加量為7g/100g蛋白。

2.1.3 時間對改性效果的影響

由圖3可以看出，當時間在2～3h之間時變化明顯，且到3h時蛋白改性效果最好，之后隨著時間的延長，NSI變化不是很明顯，所以反應時間選擇3h。

圖3 反應時間對NSI的影響Fig.3 Effect of reaction time on post-phosphorylation NSI of PPI

2.1.4 反應溫度對改性效果的影響

圖4 反應溫度對NSI的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on post-phosphorylation NSI of PPI

由圖4可以看出，隨著溫度的增加，改性后蛋白的NSI先增大后減小，溫度達到40℃時NSI達到最大，因此反應溫度選擇40℃。

2.1.5 pH值對改性效果的影響

圖5 反應體系pH值對NSI的影響Fig.5 Effect of reaction pH on post-phosphorylation NSI of PPI

由圖5可以看出，隨著pH值的增加，改性后蛋白的NSI先增大后減小，當pH值達到8時NSI達到最大值，因此pH值選擇8。

由以上試驗得出最佳反應條件為：花生分離蛋白質量分數7%，STP添加量7g/100g蛋白，反應體系pH8.0，反應溫度40℃，反應時間3h。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗分析

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Central composite design matrix and experimental values of post-phosphorylation NSI of PPI

由圖6可以看出，在所設定范圍內，隨著PPT添加量的增加NSI先變大后減小；由圖7可以看出，在所選范圍內，隨著溫度的升高，NSI逐漸變大；由圖8可以看出，在所設定范圍內，隨著pH值的增加NSI先變大后減小；由圖9可以看出，在所選范圍內，隨著時間的增加，NSI先變大后減小。

圖6 花生分離蛋白質量分數和STP添加量對NSI的影響Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of PPI concentration and STP amount on post-phosphorylation NSI of PPI

圖7 反應溫度和花生分離蛋白質量分數對NSI的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction temperature and PPI concentration on postphosphorylation NSI of PPI

圖8 pH值和花生分離蛋白質量分數對NSI的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction pH value and PPI concentration on postphosphorylation NSI of PPI

圖9 反應時間和花生分離蛋白質量分數對NSI的影響Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of reaction time and PPI concentration on post-phosphorylation NSI of PPI

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert(version7.0, Stat-EaseInc.,Minneapolis, MN. USA)軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到花生分離蛋白質量分數(X1)、STP添加量(X2)、反應pH(X3)、反應溫度(X4)、反應時間(X5)的二次多項回歸模型為：

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for fitted quadratic regression equation

表4 回歸方程可信度分析Table 4 Reliability analysis for fitted quadratic regression equation

由方差分析可知，花生蛋白磷酸化改性的回歸模型F值為237.59，模型的F值只有0.01%的可能由噪聲產生；Prob＞F＜0.0500說明模型顯著，本實驗Prob＞F＜0.0001，說明整個模型的回歸效果極顯著；X2、X3、X4、X2X3、X2X4、X22、X42對改性效果有較顯著的影響，其他因素對改性效果的影響相對較小。

失擬項反應的是實驗數據與模型不相符的情況，它的F值為53.13與整個模型的237.59相比是很小的，這說明不符合的數據相對純誤差是不顯著的，

回歸方程的復相關系數為0.9781，校正后的復相關系數的平方R2為0.9898，說明回歸方程的可信度非常高，精確度反映的是噪音比率信號，只要這一值大于4就說明是合適的。此回歸方程所得的值56.437 說明此模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以此模型來分析和預測花生分離蛋白改性效果，說明模型完全可以用來對試驗結果進行擬合。

圖10 NSI最大時STP添加量和花生分離蛋白質量分數的等高線Fig.10 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of STP amount and PPI concentration

圖11 NSI最大時反應溫度和pH值的等高線Fig.11 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of reaction temperature and pH

圖12 NSI最大時STP添加量和pH值的等高線Fig.12 Contour plot showing the maximum value of postphosphorylation NSI of PPI at different levels of STP amount and pH

由圖10～12可以得出，反應的最佳條件為三聚磷酸鈉添加量為7.77%、花生分離蛋白質量分數為6.38%、反應溫度44.85℃、反應體系pH8.24、反應時間5.68h。得到的花生改性蛋白NSI 最大值為77.74%，在此條件下，花生改性蛋白中有機磷的含量為36.2mg/g，由于引進大量的磷酸根基團，使蛋白質加工功能性得以改善。

圖13 花生蛋白粉、花生分離蛋白、花生改性蛋白功能特性Fig.13 Comparisons of oil absorption, water absorption, water capacity, emulsifying capacity, emulsion stability, foam stability among peanut protein powder and unmodified and modified PPI

2.2.3 改性效果

從圖13可以看出，通過三聚磷酸鈉改性后，花生分離蛋白的功能特性除了起泡性以外都有不同程度的提高，花生改性蛋白吸油性比花生分離蛋白的吸油性提高了14.3%，吸水性提高了150%，持水性提高了8.9%，溶解性提高了55%，乳化性提高了13.4%，乳化穩定性提高了10.3%，起泡性降低了50%，泡沫穩定性提高了124%。三聚磷酸鈉對花生分離蛋白的改性具有顯著性差異。

3 結 論

本實驗得出花生分離蛋白磷酸化改性反應的最佳條件為三聚磷酸鈉添加量7.77%、花生分離蛋白質量分數6.38%、反應溫度44.85℃、反應體系pH8.24、反應時間5.68h。得到的花生改性蛋白NSI最大值為77.74%。改性后，花生分離蛋白的功能特性除了起泡性以外都有不同程度的提高。由此可以看出，三聚磷酸鈉對花生分離蛋白的改性具有顯著效果，改性的花生分離蛋白可以廣泛應用于植物蛋白飲料和肉制品工業。

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Phosphorylation with Sodium Tripolyphosphate for Modification of Peanut Protein Isolate

XIONG Liu1,2，SUN Gao-fei2,3，WANG Jian-hua2,4，SUN Qing-jie1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. National Research and Development Center for Peanut Processing, Qingdao 266109, China；3. Qingdao Topsen Group Co. Ltd., Laixi 266600, China；4. Haidu College, Qingdao Agricultural University, Laiyang 265200, China)

Q816

A

1002-6630(2010)10-0035-07

2009-07-24

國家星火計劃項目(2007EA741007)；青島市2007年重點技術創新項目(20071359)

熊柳(1975—)，女，碩士研究生，研究方向為糧油加工。E-mail：xiongliu821@163.com

*通信作者：孫慶杰(1970—)，男，教授，博士，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。E-mail：phdsun@163.com