羅非魚多肽-鋅配合物的制備及其生物活性

許慶陵，曾慶祝,*，閆 磊，林金鶯，顧采琴，戰(zhàn) 宇，樊亞鳴，黃儒強(qiáng)

(1.廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院食品工程系，廣東 廣州 510006；2.廣州陸仕水產(chǎn)有限公司，廣東 廣州 510820；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，廣東 廣州 510631)

羅非魚多肽-鋅配合物的制備及其生物活性

許慶陵1，曾慶祝1,*，閆 磊2，林金鶯1，顧采琴1，戰(zhàn) 宇1，樊亞鳴1，黃儒強(qiáng)3

(1.廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院食品工程系，廣東 廣州 510006；2.廣州陸仕水產(chǎn)有限公司，廣東 廣州 510820；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，廣東 廣州 510631)

目的：探索羅非魚多肽-鋅配合物的制備工藝條件，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試其生物活性。方法：比較影響蛋白多肽與鋅發(fā)生配合反應(yīng)的因素，篩選適宜工藝條件，采用光譜法對(duì)配合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，并以小鼠為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇超氧化物歧化酶活力、氧化型谷胱甘肽還原酶活力、巨噬細(xì)胞吞噬百分率、超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，確定配合物的體內(nèi)外生物活性。結(jié)果：蛋白多肽-鋅配合物制備的適宜工藝條件為pH5.0、溫度80℃、蛋白質(zhì)的水解度15%、多肽與Zn的質(zhì)量比為4:1，制備配合物的得率約為54%、Zn的配合率為55%，配合物中鋅含量為6.5×104mg/kg；配合物的光譜特征峰證實(shí)多肽與Zn2+生成了一種新型配合物；配合物能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、顯著提高小鼠肝組織勻漿中SOD和腎組織中氧化型谷胱甘肽還原酶的活力，并對(duì)體外超氧陰離子自由基有很好的清除效果。結(jié)論：多肽與Zn2+在一定條件下通過(guò)配合作用生成多肽-鋅配合物，該配合物具有提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力、提高超氧化物歧化酶和氧化型谷胱甘肽還原酶活力、清除氧自由基等生物活性。

羅非魚；多肽-鋅配合物；制備：生物活性

Abstract：The preparation procedure of Zn (Ⅱ)–tilapia peptide complexes was investigated by single factor design method.Along with this, the complexes were structurally characterized and their biological activities were tested by measuring their effects on kidney GSH-Px and hepatic SOD activities and the percentage of macrophages engaged in phagocytosis in mice and in vitro superoxide anion free radical scavenging activity. Results showed that the optimal reaction conditions for the preparation of Zn (Ⅱ)–tilapia peptide complexes were as follows: pH 5.0 and 80 ℃ for a reaction between Zn (Ⅱ) and tilapia peptides contained in the tilapia meat hydrolysate with 15% degree of hydrolysis. Under such conditions, the yield of Zn (Ⅱ)–tilapia peptide complexes with a Zn content of 6.5 × 104mg/kg reached up to 54% and Zn exhibited a chelation rate of 55%. Spectral characteristics demonstrated the formation of new complexes from Zn (Ⅱ) and tilapia peptides. The complexes remarkably increased the percentage of macrophages engaged in phagocytosis and hepatic SOD and kidney GSH-Px in mice and exhibited an excellent superoxide anion free radical scavenging activity.

Key words：tilapia；Zn (Ⅱ)– tilapia peptide complexes；preparation；biological activity

2007年，我國(guó)羅非魚(tilapia)年產(chǎn)量為121萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的一半以上。羅非魚主要用于加工冷凍魚片出口歐美市場(chǎng)。由于羅非魚體形較扁，制造魚片的利用率只有整條魚的46%左右，而下腳料則高達(dá)54%以上[1]。這些下腳料主要包括魚片修整時(shí)切下的邊角魚肉、帶肉魚骨、魚頭、魚皮、魚鱗及內(nèi)臟等，至今仍未得到有效合理利用，不僅浪費(fèi)了蛋白質(zhì)資源，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

Zn作為人和動(dòng)物必需的微量元素之一，被稱為生命元素。Zn與蛋白多肽結(jié)合形成多肽–鋅配合物(有機(jī)鋅)以后，在提高動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖、增強(qiáng)抗病免疫力、調(diào)節(jié)生理代謝等方面都有重要生理作用[2-4]。有關(guān)蛋白多肽-鋅配合物的制備及其生物功能活性的研究報(bào)道不多，張亞麗[5]研究了大豆多肽絡(luò)合鋅的制備工藝條件，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試了所制備的多肽絡(luò)合鋅對(duì)油脂的抗氧化性；高素蘊(yùn)等[6]報(bào)道了大豆分離蛋白水解物絡(luò)合鋅的制備工藝條件及影響絡(luò)合反應(yīng)的因素；許慶陵等[7]介紹了合成鋅-大豆多肽配合物的影響因素。Torreggiani等[2]研究了肌肽與Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Co(Ⅱ)形成金屬配合物的結(jié)構(gòu)特征，并報(bào)道了肌肽螯合鋅對(duì)胃潰瘍的療效、肌肽螯合鐵對(duì)體液和組織中鐵離子濃度的調(diào)節(jié)作用、以及抑制鐵離子催化誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)等生物活性；Hirokazu等[3]研究結(jié)果表明，一種抗艾滋病多肽T22與Zn(Ⅱ)形成配合物以后，其抗艾滋病活性得到了很大程度提高，并對(duì)Zn-T22配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步鑒定。Vogler等[8]介紹了含有二個(gè)半胱氨酸殘基的二肽和三肽分別與Zn形成配合物的技術(shù)方法，并對(duì)所形成配合物的結(jié)構(gòu)及理化特性進(jìn)行了測(cè)試。縱觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，有關(guān)以魚蛋白為原料制備多肽以及多肽-鋅配合物，并探索其生物活性、表征其分子結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究報(bào)道不多。本文在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討羅非魚水解蛋白多肽與鋅(Zn)作用生成羅非魚多肽-鋅配合物(簡(jiǎn)稱多肽-鋅配合物)的制備工藝及其生物活性，以期對(duì)羅非魚的高值化利用及多肽-微量元素配合物的研究有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明小鼠[40只，雄性，平均體質(zhì)量(20±2)g]、基礎(chǔ)飼料(未加鋅) 廣州中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

Alcalase 2.4L FG、Neutrase、Flavourzyme 天津諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶 廣州華琪生物科技有限公司；枯草桿菌中性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；GSH-Px試劑盒、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；藍(lán)色葡聚糖2000、Giemsa(吉姆薩)染料 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白、細(xì)胞色素C、氧化型谷胱甘肽 上海源聚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV2300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；ALLEGRA-64R冷凍離心機(jī) 上海科峻儀器公司；TENSOR 27型紅外光譜儀 德國(guó) Bruker光譜儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

魚蛋白多肽的制備[9-10]：按魚肉:水=1:3(m/m)配制水解底物→55℃預(yù)熱并維持恒溫→調(diào)節(jié)pH值→加入Alcalase蛋白酶→酶解(條件為pH9.5、55℃、時(shí)間3h)→酶滅活→離心→過(guò)濾→真空濃縮→冷凍干燥→多肽樣品。

多肽-鋅配合物的制備：用多肽樣品配制一定濃度的多肽溶液→調(diào)節(jié)pH值→加入一定量鋅(Zn2+)溶液→合成反應(yīng)→沉降分離→沉淀物干燥→多肽-鋅配合物成品(每次均設(shè)置3個(gè)平行組)。

1.3.2 測(cè)定方法

配合率：采用EDTA-Na2滴定法測(cè)定鋅的配合率[8]，計(jì)算公式為：鋅的配合率/%=m1/m0×100，式中，m0為加入反應(yīng)體系中的鋅量/g，m1為配合物中的鋅質(zhì)量/g；蛋白含量：采用凱氏定氮法[11]；肽含量：采用雙縮尿法[12]；配合物結(jié)構(gòu)特征：紅外光譜儀法[13]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)測(cè)定

40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，放在一個(gè)鼠籠中飼養(yǎng)，鼠籠規(guī)格22cm×18cm×16cm。小鼠分組為：①對(duì)照組，每天灌胃生理鹽水0.4mL；②低劑量組，每天灌胃質(zhì)量濃度為0.25mg/mL的魚蛋白多肽-鋅配合物(魚蛋白多肽-鋅配合物中鋅含量為6.5×104mg/kg)溶液0.4mL；③中劑量組，每天灌胃質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的魚蛋白多肽-鋅配合物溶液0.4mL；④高劑量組，每天灌胃質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的魚蛋白多肽-鋅配合物溶液0.4mL。小鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料及飲水。飼養(yǎng)30d，飼養(yǎng)結(jié)束后，每組采集7只小鼠平行進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

SOD和GSH-Px活力測(cè)定：按照說(shuō)明書方法分別測(cè)定肝組織SOD和腎組織GSH-Px活力。

巨噬細(xì)胞吞噬百分率測(cè)定：往小鼠腹腔內(nèi)注射滅菌肉湯培養(yǎng)基1mL(巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑)→24h后再注射1%雞紅細(xì)胞懸液1mL→間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠→將其仰臥固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，輕揉腹部1min→然后吸出腹腔洗液1mL，于2片載玻片上涂勻→移置37℃孵箱溫育30min→孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞→晾干→以1:1丙酮甲醇溶液固定5min→1:10(V/V) Giemsa-磷酸緩沖液染色30min→再用蒸餾水漂洗→晾干→顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的情況。通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計(jì)數(shù)100個(gè)，按下式計(jì)算吞噬百分率。

配合物對(duì)超氧自由基的清除率測(cè)定：鄰苯三酚比色法[14]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件包中的ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析，多重比較選用LSD法和Tamhanes T2法。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響多肽與Zn2+配合反應(yīng)的因素

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響

設(shè)定pH7，多肽與Zn的質(zhì)量比為4:1，反應(yīng)時(shí)間30min，溫度分別為30、40、50、60、70、80、90、100℃等條件下，多肽與鋅反應(yīng)生成多肽-鋅配合物的得率及配合率見(jiàn)圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes yield and the percentage of Zn engaged in chleation

從圖1可看出，在80℃以下，隨著反應(yīng)溫度的逐漸上升，多肽-鋅配合物的得率及Zn2+的配合率都不斷增加，到80℃以后，得率增加緩慢，而配合率則稍有降低。說(shuō)明溫度對(duì)配合反應(yīng)有影響，溫度升高有利于多肽與Zn2+的接觸與結(jié)合，但溫度過(guò)高，可能使分子運(yùn)動(dòng)加快反而不利于多肽與Zn2+的結(jié)合作用。因此，選定80℃作為反應(yīng)的適宜溫度。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響

在pH7，多肽與鋅的質(zhì)量比為4:1，溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80min等條件下，多肽與鋅發(fā)生配合反應(yīng)生成多肽-鋅配合物的得率及配合率見(jiàn)圖2。可以看出，在30min之前，反應(yīng)速度很快，隨著時(shí)間的增加，得率及配合率都得到快速提高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到30min以后，得率及配合率增幅很低，基本不再增加。因此，說(shuō)明多肽與鋅的配合反應(yīng)速度較快，在30min內(nèi)能夠基本完成。因此，反應(yīng)時(shí)間選擇30min即可。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of reaction time on Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes yield and the percentage of Zn engaged in chleation

2.1.3 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響

圖3 pH值對(duì)鋅配合率的影響Fig.3 Effect of pH on Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes yield and the percentage of Zn engaged in chleation

由圖3可以看出，pH值對(duì)得率及配合率都有較大影響。其中，pH5時(shí)得率及鋅配合率已達(dá)最高。當(dāng)pH值超過(guò)7，由于產(chǎn)生Zn(OH)2沉淀，同時(shí)溶液中的部分蛋白多肽也會(huì)被沉淀，導(dǎo)致溶液中蛋白多肽和游離Zn2+的含量均有所減少，鋅的配合率降低。當(dāng)pH值小于5時(shí)，得率及鋅配合率也不高，可能是H+濃度增加不利于Zn2+與多肽分子之間的結(jié)合。因此，選定pH5作為制備的適宜酸度。

2.1.4 蛋白水解度(DH)對(duì)配合反應(yīng)的影響

圖4顯示，蛋白質(zhì)的水解度對(duì)配合物的得率有影響，隨DH的升高，得率緩慢降低。相比之下，水解度對(duì)Zn配合率的影響較大，水解度越大，Zn配合率越高。由于蛋白質(zhì)的水解度與多肽分子質(zhì)量分布有密切關(guān)系，一般來(lái)講，水解度越大，多肽的平均分子質(zhì)量就越小，多肽與Zn2+的配合作用更加容易，因而Zn配合率會(huì)逐漸增加。而得率降低可能是由于小肽太多，其總含量超過(guò)了與Zn2+配合的適宜比例，那么配合物的得率就相對(duì)降低。當(dāng)水解度達(dá)到15%以后，鋅配合率增加幅度不大。因此，綜合考慮，選擇水解度15%為宜。

圖4 水解度對(duì)鋅配合率的影響Fig.4 Effect of protein hydrolyzing degree on Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes yield and the percentage of Zn engaged in chleation

2.1.5 多肽與鋅的質(zhì)量比對(duì)配合反應(yīng)的影響

在適宜溫度及時(shí)間、水解度為15%的條件下，多肽與鋅的質(zhì)量比對(duì)多肽-鋅配合物的得率及配合率的影響見(jiàn)圖5。可以看出，多肽與鋅質(zhì)量比對(duì)得率及配合率的影響都較大。當(dāng)多肽與鋅質(zhì)量比低時(shí)，多肽分子中的配位基團(tuán)與Zn2+之間接觸機(jī)會(huì)減少，得率及配合率不高。多肽與鋅質(zhì)量比增加，得率及配合率也相應(yīng)有所提高，當(dāng)多肽與鋅的質(zhì)量比為4:1時(shí)，得率及鋅配合率最高，分別為55%和54%。隨著多肽與鋅質(zhì)量比的進(jìn)一步增加，Zn2+與多肽分子中的配位基團(tuán)結(jié)合受阻，發(fā)生配合作用的概率不再增加，因而配合物的得率及配合率就不增加。

圖5 多肽與鋅質(zhì)量比對(duì)鋅配合率的影響Fig.5 Effect of degree of hydrolysis of tilapia meat hydrolysate on Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes yield and the percentage of Zn engaged in chleation

2.2 多肽-鋅配合物的光譜特征

2.2.1 多肽-鋅配合物的紅外光譜特征

分別測(cè)定了多肽(PEP)和多肽-鋅配合物(Zn-PEP)的光譜特性，見(jiàn)圖6。

從圖6可知，多肽及多肽-鋅配合物(鋅-PEP)的FTIR光譜在強(qiáng)度和吸收頻率方面均存在較大差異。PEP在3392.96cm-1處的吸收峰在Zn-PEP中移至3325.67cm-1，紅移了67.92cm-1；PEP合成Zn-PEP后，在3080.61cm-1處的吸收峰消失；這些譜帶分別對(duì)應(yīng)著PEP的NH對(duì)稱伸縮振動(dòng)和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)。說(shuō)明多肽分子的氨基和羧基都參與了Zn2+的配位，而且PEP中與Zn結(jié)合的氧同NH之間還可能存在著氫鍵。PEP在2970.89cm-1處的吸收峰在Zn-PEP中移至2968.85cm-1，紅移了2.04cm-1，紅移前后是PEP中CH2、CH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)，這說(shuō)明Zn2+與PEP的作用而導(dǎo)致PEP結(jié)構(gòu)構(gòu)型的部分改變。PEP合成Zn-PEP后，在2084.13cm-1處的吸收峰消失；PEP在1662.11cm-1處的吸收峰在Zn-PEP中移至1654.34cm-1，紅移了7.77cm-1，這是COO－或CO伸縮振動(dòng)，說(shuō)明PEP中羧基的氧參與了Zn2+的配位作用。PEP在1583.22cm-1處的吸收峰消失，進(jìn)一步說(shuō)明羧基上的氧直接與Zn2+有直接的配位作用。PEP在1452.59、1398.70、1319.41、1161.86、1115.31、1079.64、1049.05cm-1等處的吸收峰發(fā)生的紅移，都表明PEP與Zn2+有配位作用，并生成了新的配合物。PEP在1262.64cm-1處的吸收峰消失，表明殘基上的氨基和羧基氧均可能與Zn2+直接成鍵，并由氫鍵締合作用。Zn-PEP在878.56cm-1處附近的吸收峰加強(qiáng)和在602.26cm-1處吸收峰的紅移，有可能是Zn2+與N、O所形成的配合鍵的伸縮振動(dòng)引起。

圖6 多肽及多肽-鋅配合物的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of tilapia peptides and their complexes with Zn (Ⅱ)

圖7 多肽及多肽-鋅配合物的紫外光譜圖Fig.7 Ultraviolet absorption spectra of tilapia peptides and their complexes with Zn

2.2.2 多肽-鋅配合物的紫外光譜特征

多肽和多肽-鋅配合物的紫外吸收光譜見(jiàn)圖7。多肽的最大吸收峰在210nm處(圖7A)，這是由肽鍵上羰基(C＝O)n→π*電子躍遷引起的；配合物的最大紫外吸收峰在216nm處(圖7B)，與多肽的最大吸收峰210nm處相比，位移了6nm，這是由于Zn2+與多肽中的N、O形成配合鍵后，影響了肽鍵上羰基(C＝O)n→π*的電子躍遷。另外，配合物在272nm處有一個(gè)較弱的新吸收峰出現(xiàn)，這是配體(N－C－O)中π→π*電子躍遷所致。綜合紅外及紫外光譜解析結(jié)果可知，Zn2+與多肽分子的N、O之間形成了配合鍵，引起多肽分子骨架的部分變化，配合作用發(fā)生在氨基殘基和肽鍵的N、O原子上。

2.3 多肽-鋅配合物的生物活性

2.3.1 多肽-鋅配合物對(duì)腎GSH-Px活力的影響

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，多肽-鋅配合物對(duì)小鼠腎GSH-Px、肝SOD和腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響見(jiàn)表1。給小鼠灌喂低劑量的配合物，GSH-Px活力便得到顯著提高，對(duì)照組的GSH-Px活性均顯著低于各劑量組。GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶，具有清除H2O2與氫過(guò)氧化物等作用。GSH-Px活力的提高，有助于提高機(jī)體的抗氧化能力。配合物對(duì)GSH-Px活性的影響可能與鋅水平有關(guān)。張文敏等[15]研究了人血清中Zn水平與GSH-Px活性的關(guān)系，

結(jié)果認(rèn)為正常人體血清Zn水平與GSH-Px活性呈明顯的正相關(guān)。

2.3.2 多肽-鋅配合物對(duì)肝SOD的影響

從表1可以看出，3個(gè)劑量組的SOD活力與對(duì)照組有顯著性差異，中低劑量組與高低劑量組之間也有顯著差異，說(shuō)明配合物能顯著提高SOD活力。曹國(guó)華等[16]研究認(rèn)為，不同補(bǔ)鋅劑量對(duì)SOD有較大的影響，適度的補(bǔ)鋅量能真正利于小鼠的機(jī)體健康。因此，配合物提高SOD活力可能與其含有的鋅元素有關(guān)。

2.3.3 多肽-鋅配合物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性物質(zhì)具有吞噬功能。如果將待測(cè)巨噬細(xì)胞與吞噬顆粒(如雞紅細(xì)胞、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等)混合溫育一定時(shí)間，顆粒物質(zhì)可被巨噬細(xì)胞吞噬。因此，可根據(jù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)反映巨噬細(xì)胞的吞噬活力。從表1可以看出，低劑量組與對(duì)照組無(wú)差異，中、高劑量組與對(duì)照組有明顯差異，中低、高低劑量組之間也有明顯差異。因此，可以認(rèn)為，多肽-鋅配合物對(duì)提高機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬活力有顯著作用。機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬活力的提高可能與配合物中多肽及鋅兩種組分都有關(guān)系。

表1 多肽-鋅配合物對(duì)小鼠腎GSH-Px、肝SOD和腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響(±s，n=7)Table 1 Effects of Zn-peptides complexes on kidney GSH-Px and hepatic SOD activities and the percentage of macrophages engaged in phagocytosis in mice (±s，n=7)

表1 多肽-鋅配合物對(duì)小鼠腎GSH-Px、肝SOD和腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響(±s，n=7)Table 1 Effects of Zn-peptides complexes on kidney GSH-Px and hepatic SOD activities and the percentage of macrophages engaged in phagocytosis in mice (±s，n=7)

注：同列數(shù)據(jù)肩注字母不同者表示差異顯著(P<0.05)。

組別 GSH-Px活力/(U/mg)SOD活力/(U/mg) 吞噬百分率/%對(duì)照組(A) 55.63±7.52a 105.43±5.63a 35.71±2.31a低劑量組(B) 99.15±7.13b 139.59±8.03b 38.86±1.96a中劑量組(C) 117.39±10.00c 190.16±23.48c 42.71±3.65b高劑量組(D) 110.95±14.65bc 218.46±25.66c 42.57±3.33b

2.3.4 多肽-鋅配合物對(duì)體外超氧陰離子自由基的清除作用

由圖8可以看出，多肽-鋅配合物對(duì)體外超氧陰離子自由基有一定清除作用，并且這種作用隨著配合物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)多肽-鋅配合物質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)，它對(duì)體外超氧陰離子自由基的清除率不再增加。多肽-鋅配合物對(duì)體外超氧陰離子自由基的清除作用機(jī)理尚不清楚，可能是多肽-鋅配合物本身具有抗氧化作用，例如，張亞麗[5]的研究表明大豆多肽絡(luò)合鋅對(duì)油脂有抗氧化性；也可能是配合物中的多肽組分在發(fā)揮作用，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)有多種多肽都具有抗氧化活性[17]。

圖8 多肽-鋅配合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.8 Concentration dependence of scavenging rate of Zn (Ⅱ)-tilapia peptide complexes against superoxide anion free radicals

3 結(jié) 論

在適宜條件下，魚肉水解蛋白多肽能夠與Zn2+發(fā)生配合作用生成多肽-鋅配合物。配合物的光譜特征表明，Zn2+與多肽分子中的氨基殘基和肽鍵的N、O原子發(fā)生配合作用形成配合鍵。所制備的多肽-鋅配合物體現(xiàn)出一定地增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、提高肝組織SOD和腎組織GSH-Px的活力、清除超氧陰離子自由基等生物活性。

[1] 吳燕燕, 李來(lái)好, 岑劍偉. 酶法由羅非魚加工廢棄物制取調(diào)味料的研究[J]. 南方水產(chǎn), 2006, 2(1): 49-53.

[2] TORREGGIANI A, FINI G, BOTTURA G. Effect of transition metal binding on the tautomeric equilibrium of the carnosine imidazolic ring[J]. Journal of Molecular Structure, 2001, 30(565/566): 341-346.

[3] HIROKAZU T, AKIRA O, TSUTOMU M. An anti-HIV peptide, T22,forms a highly active complex with Zn(II)[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, 229(2): 648-652.

[4] BUGLYO P, NAGY E M, FARKAS E. New insights into the metal ionpeptide hydroxamate interactions: Metal complexes of primary hydroxamic acid derivatives of common dipeptides in aqueous solution[J]. Journal of Polyhedron, 2006, 12(14): 1-9.

[5] 張亞麗. 脫脂豆粕多肽絡(luò)合鹽的應(yīng)用特性研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 21(1): 93-95.

[6] 高素蘊(yùn), 潘思軼, 郭康權(quán). 大豆分離蛋白水解物螯合鋅(Ⅱ)的合成與制備[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(10): 117-120.

[7] 許慶陵, 閆磊. Zn(Ⅱ)-大豆多肽配合物的合成[J]. 食品科技, 2008(8): 31-34.

[8] VOGLER R, GELINSKY M, GUO L F, et al. Solution behaviour and zinc complexation of di- and tripeptides with two cysteine units[J].Inorganica Chimica Acta, 2002, 339: 1-8.

[9] 曾慶祝, 許慶陵. 酶解-膜分離組合制備ACE抑制肽[J]. 食品科學(xué),2008, 29(2): 229-233.

[10] 曾慶祝, 許慶陵, 黃儒強(qiáng). 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的分離[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2007, 31(6): 818-824.

[11] 大連輕工業(yè)學(xué)院. 食品分析[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1994: 98-235.

[12] 張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化試驗(yàn)方法和技術(shù)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 1997.

[13] 中本一雄. 無(wú)機(jī)及配位化合物的紅外和拉曼光譜[M]. 黃德如, 汪仁慶, 譯. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 1981.

[14] 王春波, 賀孟泉, 秦守哲. 海洋膚的體外抗氧化作用[J]. 中國(guó)海洋藥物, 1998, 67(3): 15-17.

[15] 張文敏, 張萌, 姜桔紅. 腫瘤-睪丸抗原LAGE-1基因的原核表達(dá)純化和抗血清制備[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2006, 13(15): 1154-1157.

[16] 曹國(guó)華, 陳吉棣, 劉小鵬. 運(yùn)動(dòng)、鋅銅營(yíng)養(yǎng)與自由基代謝. Ⅵ. 不同量鋅補(bǔ)充對(duì)缺鋅運(yùn)動(dòng)小鼠體內(nèi)自由基生成與清除的影響[J]. 中華運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 1992, 82(1): 423-425.

[17] 鄭惠娜, 章超樺, 曹文紅. 海洋蛋白酶解制備生物活性肽的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(7): 370-373.

Preparation and Biological Activities of Zn (Ⅱ)–Tilapia Peptide Complexes

XU Qing-ling1，ZENG Qing-zhu1,*，YAN Lei2，LIN Jin-ying1，GU Cai-qin1，ZHAN Yu1，F(xiàn)AN Ya-ming1，HUANG Ru-qiang3
(1. Department of Food Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006,China；2. Guangzhou Lushi Fisheries Co. Ltd., Guangzhou 510820, China；3. Department of Bioengineering, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

S985.1

A

1002-6630(2010)10-0075-06

2009-09-09

廣州市屬高校科技計(jì)劃項(xiàng)目(廣州市教育局08C082)；廣州大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2007)

許慶陵(1965—)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，學(xué)士，主要從事生物活性物質(zhì)制備及其應(yīng)用研究。

E-mail：qinglingxu65@yahoo.com.cn

*通信作者：曾慶祝(1965—)，男，教授，博士，主要從事生物活性物質(zhì)制備及其應(yīng)用研究。E-mail：zqz@gzhu.edu.cn