家兔微血栓栓塞中風模型的建立及應用

王維亭，于 冰，趙專友，湯立達

（天津藥物研究院藥效動力學重點實驗室，天津 300193）

腦卒中發病率高、后果嚴重，是死亡與致殘的最主要疾病之一。隨著對腦梗死治療的研究進展，逐漸認識到了多功能、多作用靶點治療藥物對于臨床預后的優越性，尤其是兼具溶栓、降纖、血小板聚集抑制等多功能的藥物，但目前對該類藥物的研發尚缺乏合理的、有針對性的實驗模型。本試驗建立了一種可用于多功能藥物藥效學評價的新的微血栓栓塞中風模型，該模型適用于亞急性或慢性試驗，并通過巴曲酶驗證了其應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器、動物與試藥

XHF－1型高速分散器（上海金達生化儀器廠）；HS3120型超聲振蕩器（天津市恒奧科技發展有限公司）；PK121R型低溫冷凍離心機（意大利ALC公司）；Model550型光吸收酶標儀（美國Bio－RAD公司）；Parber凝血因子分析儀(北京世帝公司)。雄性新西蘭大白兔，體重(2.0 ～2.7)kg，平均（2.4 ±0.2)kg，由天津藥物研究院實驗動物中心提供，動物合格證號為津實動質字第001號。巴曲酶[Batroxobin，5個巴曲酶單位（BU）/0.5 mL，北京托比西藥業有限公司，批號為20041127]。組織型纖溶酶原激活劑（t－PA）含量測定試劑盒（上海太陽生物技術公司，批號為41110）。

1.2 模型制備

微栓子制備：自供體家兔頸動脈取全血5 mL，凝固后置37℃水浴中老化3 h,取出血凝塊,剪碎，懸浮于含0.1%小牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽生理鹽水緩沖液（PBS）中,經高速分散器在5 000 r/min及10 s的條件下粉碎，收集通過230!m×230!m的尼龍篩網的微栓子,再經130!m×130!m的尼龍篩網過濾，將留于網上的血栓懸浮于PBS中備用。微栓子大小在130～230!m之間。

栓塞過程：取雄性家兔，體重（2.4±0.2)kg,乙醚麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，頸部去毛，分別以碘酒、酒精消毒手術野，頸正中線切開,分離皮下組織及筋膜；游離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。頸外動脈遠端結扎，近段切口，插入充滿生理鹽水（NS）的PE50管并逆向行進至頸內動脈。取上述制備的不同量的微栓子，吸干稱重后，懸浮于2 mL PBS中，快速推入腦內，再用5 mL NS緩慢沖洗。沖洗完畢后抽出插管并結扎頸外動脈切口，縫合手術傷口，肌肉注射青霉素(10萬U)后，回籠飼養。

1.3 分組及給藥

將動物分為3組，即模型組（A組）、巴曲酶低劑量組（B1組）、巴曲酶高劑量組（B2組），每組20只。栓塞造模后5 min，經耳緣靜脈給藥，給藥體積5 mL,給藥時間5 min。A組給予NS，B1組及B2組給予巴曲酶，劑量分別為0.5 BU/kg和1.0 BU/kg。

1.4 測定指標

致半數卒中微栓子量(ES50,effective stroke dose)：注射微栓子后出現神經癥狀者為異常動物（以1表示），無癥狀者為正常動物（以0表示）。藥物治療后6 h及24 h時，觀察注射不同量微栓子后出現的異常卒中動物數，求出不同時間的 ES50，以此考察藥物對腦卒中的治療作用。

t－PA含量測定：造模前及給藥后1 h，經心臟取血2 mL，以1/10體積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min轉速低溫(4℃)離心10 min，－20℃保存。采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法，用酶標儀在490 nm波長處測定光吸收度，計算t－PA含量。

纖維蛋白原（Fbg）含量測定：造模前及給藥后1,2,4,6,24 h時，經心臟取血2 mL，以1/10體積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min轉速低溫(4℃)離心10 min，－20℃保存。采用凝固法測定Fbg含量。

腦出血觀察：給藥后24 h，耳緣靜脈注射20%烏拉坦1 g/kg麻醉，開胸，分別用NS和4%多聚甲醛PBS依次經心臟灌注固定大腦，開顱取腦，置4%多聚甲醛PBS繼續固定。1周后，將大腦沿冠狀面切成5 mm厚的切片，依據下列標準盲法觀察腦出血情況。出血類型分為4類，即蛛網膜下腔出血(SAH，在大腦表面的軟腦膜下有肉眼可見的血液）、出血性梗死(HI，在松軟的梗死組織中出現紅色斑點）、點狀出血(PT，在腦組織內出現散在的小紅斑）、實質性腦內出血(ICH，腦組織內有大片的血液）。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 對 ES50及t－PA含量、Fbg含量的影響

結果見表1。可見，隨著顱內注入微栓子量的增加，動物出現中風的幾率明顯增加，ES50值提示注入0.63 mg栓子6 h時即可使半數動物出現中風癥狀；予巴曲酶0.5 BU/kg治療6 h及24 h后ES50,分別提高了2.2倍和1.8倍。A組t－PA含量在給藥前及給藥后基本保持穩定，有降低趨勢；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后1 h可使t－PA含量明顯增加，較A組分別增加14.04%和23.25%。A組Fbg含量在給藥前及給藥后基本保持穩定；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后可使Fbg含量明顯降低，與給藥前比較有顯著性差異，以給藥后6 h最為明顯。

表1 各組 ES50及 t－PA含量、Fbg含量測定結果（n=20，±s）

表1 各組 ES50及 t－PA含量、Fbg含量測定結果（n=20，±s）

注：與 A 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01；與給藥前比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

組別 劑量（BU/kg） ES50 t－PA(ng/mL)Fbg(g/L)A照 －B1組B2組0.5 1.0 6 h 0.63±0.57 1.41±0.51△2.00±0.59△24 h 0.52±0.54 0.93±0.65 1.44±0.47△基線2.42±1.04 2.39±1.00 2.38±0.69 1 h 2.28±0.85 2.60±0.96 2.81±1.08▲給藥前3.47±1.06 3.53±0.70 3.51±1.31 1 h 3.53±1.17 3.13±0.93□2.88 ±0.72△□2 h 3.52±0.77 2.98±1.04□2.87 ±1.11△■4 h 3.53±0.70 2.87±1.26□2.84±1.15△□6 h 3.47±0.90 2.82 ±0.81△□2.63 ±1.27△■24 h 4.57±1.59 4.14±1.56 4.13±1.34

2.2 對腦出血的影響

結果見表2。可見，巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后對腦出血類型及出血率無明顯影響。

表2 兔大腦中動脈微血栓栓塞后出血類型及巴曲酶的作用（n=20）

3 討論

大多數缺血性腦卒中是由血栓堵塞腦動脈所致，其中大腦中動脈是常見的栓塞血管。近年來，腦梗死溶栓治療的臨床應用及其病理生理機制探索有了較大進展，同時溶栓藥物的研究及用于評價溶栓藥物藥效學的模型受到了極大關注，因此，建立穩定、客觀、科學的動物模型對于溶栓藥物研究具有重要意義。

目前，用于腦梗死溶栓藥物評價的方法主要包括血管內注入復合血栓誘導劑[1]、光化學法[2－3]及注入血栓栓子法。血管內注入復合血栓誘導劑一般適用于小動物，觀察指標較單一；光化學法需向動物體內注入光化學誘導劑，栓塞部位在皮層、呈彌漫性，且誘導劑對生化指標的檢測有一定干擾；栓子注入法最常用，國內多采用大栓子栓塞法評價溶栓藥溶栓的效果，一般為急性試驗研究。注入血栓栓子栓塞大腦中動脈的方法，不需開顱，且較符合臨床大血管栓塞特征。家兔是制作該模型的最常用動物，其顱內外血管之間無網狀吻合，與狗或貓相比更接近于人類[4]，且動物溫馴、血容量大，便于多指標研究。目前國內以家兔制作大腦中動脈血栓栓塞的方法一般采用大栓子，栓子規格為直徑 0.5～1.0 mm、長 0.5～1.0 mm，栓子質量為 2.5 ～ 3.5 mg[5－6]。該模型一般用于急性腦梗死研究（＜24 h）,但不便于對腦梗死進行長期、動態的觀察。筆者參考國外方法建立了一種新的模型，即微血栓栓塞模型[7－9]。該模型利用神經癥狀反應的量子關系（有或無）及幾率，采用非線性擬合方法來評價藥物的作用，避免了神經反應輕重程度判斷的主觀性，以及梗死程度與反應程度可能非正性相關的缺陷，同時可長期動態觀察。國外研究者有觀察至21 d的報道[10]。該模型上，少量微栓子栓塞大腦中動脈的范圍較小，不引起家兔神經學行為異常；當栓子量加大時，栓塞范圍也增加，動物出現行為異常的幾率也增加，行為異常可表現為現眼球震顫、頭傾斜或擺動、轉圈、肢體偏癱或失平衡、肌陣攣甚至死亡。

頸內動脈進入顱內后與Willis環相連，Willis環上血管分支較多，包括大腦前動脈及交通支、后動脈及交通支、椎動脈等。顱內血管分布復雜，從頸內動脈注入栓子后，栓塞的部位目前一般認為是大腦中動脈，而且被許多檢測手段如數字減影血管造影（DSA）證實[11－12]，但國內、外對為何會栓塞到同側大腦中動脈而不栓塞到其他血管的現象尚無科學合理的解釋。為此，筆者結合實驗現象、解剖學及流體力學提出了“對稱結構與壓力平衡”設想：腦底部Willis環是左右對稱結構，位于大腦前動脈交通支中點及大腦后動脈交通支中點，該處左右壓力相等，相互抵消，血流處于相對靜止狀態，即左右兩側血液互不流通。另外，大腦中動脈血流分布供應占大腦的2/3，占Willis環血流的絕大多數，即大腦中動脈血流為優勢血流。在這些前提下，當頸內動脈栓子在等于或低于血壓值的壓力下進入顱內后，大多數血栓便隨優勢血流進入大腦中動脈，而不會越過交通支進入對側，進入其他動脈的幾率也較低。

巴曲酶是從蛇毒中提取的一種高純度類凝血酶樣物質，由231個氨基酸組成,能增加纖溶酶原激活劑的釋放，降低提取血液中Fbg水平、降低血黏度、降低外周血管阻力，近年來廣泛用于治療缺血性腦血管疾病，治療急性腦梗死的療效肯定[13－14]。本研究結果表明，對于微血栓栓塞性腦中風模型，巴曲酶可明顯提高 ES50值且能促進t－PA釋放，這可能是其溶栓作用機制之一；同時也表明，該模型在評價腦梗死的溶栓、降纖等藥物方面科學、合理，結果可靠。

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