黃瓜灰霉病拮抗放線菌的篩選

關麗杰, 楊 迪, 譚國梁

(沈陽化工大學環境與生物工程學院,遼寧沈陽 110142)

黃瓜灰霉病拮抗放線菌的篩選

關麗杰, 楊 迪, 譚國梁

(沈陽化工大學環境與生物工程學院,遼寧沈陽 110142)

從遼寧、北京等不同地區采集土壤樣品 25份,采用平板稀釋分離法得到放線菌,通過抑菌圈法篩選獲得對黃瓜灰霉病病原菌 (Botrytis cinereaPers.)有抑制作用的拮抗放線菌.采用牛津杯法對 28株拮抗菌發酵液進行復篩,抑菌圈直徑≥15 mm的拮抗菌有 16株,其中 4株抑制作用明顯,抑菌直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

灰葡萄孢菌; 拮抗菌; 篩選

由灰葡萄孢菌 (Botrytis cinereaPers.)引起的植物灰霉病目前已成為茄果類、瓜類、蔥韭類、漿果類等多種果蔬作物生產的主要限制因素[1].20世紀 70年代以來,相繼采用多種化學殺菌劑控制此病的危害,但由于該病原菌遺傳變異大,適應性強,已經產生了抗藥性[2-4].

放線菌作為一種具有豐富資源的微生物類群,其產生的抗生素及其他次生代謝物質在農作物病蟲害生物防治方面具有重要作用,是具有應用價值和經濟價值的一類微生物,在植物病蟲害生物防治中具有開發應用前景[5-6].近 10年來從微生物中發現的新活性物質 902個,其中放線菌產生的有 668個,占 74%.不僅如此,放線菌還產生其他各種工農業有用的產品,如醇制劑等.此外,放線菌還可以合成淀粉酶、纖維素酶、氨基酸及維生素等多種有用的代謝產物.

利用放線菌產生的活性物質進行植物病原真菌病害的生物防治,具有周期短、易于研究、便于生產、無毒無害等優點[7-8].放線菌作為最早應用到生物防治中的微生物,由于其有很強的分解纖維素、石蠟、瓊脂、角蛋白和橡膠等復雜有機物的能力,故它們在自然界物質循環和提高土壤肥力等方面有著重要的作用.隨著科技的發展,拮抗放線菌必將會廣泛應用于微生物農藥的研制和生產.我國幅員遼闊,地形、氣候復雜,生態多樣,放線菌的種類與資源比其他國家更非富,亟待深入研究與開發.本文通過抑菌圈法從土壤樣品中篩選得到了對黃瓜灰霉病病菌有強烈抑制作用的放線菌菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣來源

從遼寧、北京、河北、黑龍江、內蒙古等省蔬菜地、森林土壤中隨機采集土樣 25份.

1.1.2 供試菌種

黃瓜灰霉病病菌 (B otrytis cinereaPers.),由沈陽化工大學生物工程教研室分離并保存.

1.1.3 發酵培養基

培養基 1:淀粉 4.7 g,花生粉 2.2 g,酵母粉0.2 g,(NH4)2SO40.27 g,CaCO30.27 g,NaCl 0.27 g,pH=7.2.

培養基 2:淀粉 4.7 g,(NH4)2SO40.4 g,花生餅粉 3.3 g,CaCO30.4 g,NaCl 0.4 g,pH=7.0.

培養基 3:花生餅粉 2.5 g,淀粉 5.0 g,酵母粉 0.08 g,葡萄糖 0.02 g,(NH4)2SO40.08 g, CaCO30.32 g,NaCl 0.2 g,pH=7.0～7.2.

培養基 4:黃豆餅粉 3 g,玉米粉 2 g,葡萄糖2 g,(NH4)2SO40.4 g,CaCO30.4 g,K2HPO40.02 g,pH=7.0～7.2.

培養基 5:葡萄糖 3 g,玉米面 3 g,黃豆餅粉3 g,(NH4)2SO40.4 g,MgSO40.04 g,酵母膏 0.4 g,pH=7.0～7.2.

培養基 6:麩皮 1 g,淀粉 1.33 g,葡萄糖 0.67 g,NaCl 0.05 g,MgSO40.05 g,K2HPO40.05 g,Fe-SO40.005 g,KNO30.1 g,pH=7.2～7.4.

1.2 實驗方法

1.2.1 放線菌的分離與純化

采用稀釋分離法處理采集的土壤樣品.培養基為高氏 1號瓊脂培養基.具體操作如下:

稱取研細的分離土樣 5 g,加入盛有 45 mL滅菌水的三角瓶中,充分振蕩 10 min,吸取 1 mL混懸液,用無菌水梯度稀釋.選擇 10-3、10-4和10-5三個濃度的懸浮液 0.1 mL放到培養基上,用涂布棒涂勻,然后將培養皿倒置于 28℃恒溫培養箱內培養 4～10 d,每天進行觀察并挑選菌落形態各不相同的菌株及時轉接到斜面上培養,并編號保存.

1.2.2 拮抗放線菌的初篩

以黃瓜灰霉病病菌為靶標,采取抑菌圈法進行拮抗放線菌篩選.

將活化的黃瓜灰霉病菌制成孢子懸液 (光學顯微鏡 20×40倍下,80個/視野),吸取 15 mL加入 250 mL熔融態 PDA培養基,制成混菌平板,等距離放置直徑 7 mm的放線菌菌塊,28℃恒溫培養 4 d后十字交叉法測量抑菌圈直徑.抑菌圈直徑≥15 mm的菌株進入復篩.

1.2.3 拮抗放線菌的復篩

復篩采用牛津杯法.混菌平板上等距離放置無菌牛津杯,加樣量 200μL,28℃恒溫培養 3 d,十字交叉法測量抑菌圈直徑.抑菌圈直徑≥15 mm菌株重復發酵,測定抑菌效果.

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離與純化

從遼寧、北京、河北、黑龍江、內蒙古等省蔬菜地、森林土壤中隨機采集土樣 25份,采用稀釋分離法得到放線菌 521株.將這些菌株在高氏一號斜面上培養,4℃保存,備用.

2.2 拮抗放線菌的初篩

活體抑菌實驗表明,抑菌圈直徑≥15 mm的菌株共有 28株 (見表 1).

表 1 放線菌活體對黃瓜灰霉病的抑菌活性Table 1 Inhibition of antagonisisticactinom ycetestoBotrytis cinerea

2.3 拮抗放線菌的復篩

28個菌株經 6種不同培養基發酵后,抑菌實驗結果表明:有 16株菌在其合適的發酵培養基中發酵后,發酵液有明顯的抑菌活性,抑菌圈直徑≥15 mm,且清晰透明(見表 2,圖 1).

表2 不同發酵培養基的拮抗菌發酵液對病原菌的抑菌活性Table 2 The inhibition effect of the fermented broth from the different cultured media againstBotrytis cinerea

圖 1 拮抗菌發酵液對黃瓜灰霉病病菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of the fermented broth againstBotrytis cinerea

其中菌株 7-16、7-29、13-25和 7-37的發酵液抑菌活性較高,抑菌直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

3 結論與討論

實驗通過抑菌圈法從 521株放線菌中初篩得到對黃瓜灰霉病有拮抗作用的菌株 28株;采用牛津杯法對 28株拮抗放線菌株的 6種不同培養基發酵液進行復篩,16株拮抗菌的發酵液對病原菌有抑制作用,其中 4株抑制作用明顯,其抑菌圈直徑分別為:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和57.9 mm.其抑菌圈直徑均大于 57 mm,這將為今后黃瓜灰霉病生防制劑的開發奠定基礎.

放線菌分布廣泛,形狀差別大,沒有普遍使用的分離方法和培養基,固從樣本中分離的放線菌遠低于實際數量.進行放線菌資源開發,獲得新菌種是必要條件之一,分離方法的研究顯得越發重要,尋找新思路,改進分離篩選方法,是目前放線菌研究面臨的重大問題之一.

[1] 楊燕濤.國內保護地蔬菜灰霉病侵染規律及防治技術研究進展[J].農藥,2003,42(l):6-10.

[2] 周明國,葉鐘音,杭建勝.對多菌靈具有抗性的草葛灰霉病菌菌株形成與分布研究[J].南京農業大學學報,1990,13(3):57-60.

[3] 丁中,劉峰,王會利,等.番茄灰霉菌的多重抗藥性研究[J].山東農業大學學報,2001,32(4):452-456.

[4] 紀明山,祁之秋,趙平,等.番茄灰霉病菌對崛霉胺抗藥性的試驗 [J].沈陽農業大學學報,2002,33 (5):345-347.

[5] Forster S M.O rangic Components Process[J].Soil Science,1969,33:420-423.

[6] V an A rsdall R T,Frantz C.Potential Role of Farm er Cooperatives in Reducing Pest Risk:Final Report [EB/OL].(2001)[2009-12-7].http://www. pesp.org/2000/ncfcooifinal.htm.

[7] CoyierD L,Covey R P.Tolerance of Erw inia Am ylovora to Streptom ycin Sulfate in O regon andwashington[J].Plant D is.Rep.,1975,59:849-852.

[8] 黃昌華,郭崇明.B-HCH菌株發酵濾液對植物病原真菌的作用 [J].中國生物防治,1996,12(3): 107-109.

Screening ofAntagonistic Actinomyces againstBotrytis Cinerea Pers.

GUAN L i-jie, YANG D i, TAN Guo-liang
(Shenyang U niversity of Chem ical Technology,Shenyang110142,China)

Streptomyces strains w ere isolated from25soil samples collected from L iaoning.U sing zone of inhibition as the screening m ethod,Streptom yces strains that had inhibition of antagonistic actinom ycetes on Botrytis cinerea w ere obtained.O xford cup m ethod was adopted to re-screen28Streptom yces strains.16Streptm yces strains had diam eter of inhibition zone≥15mm.4antagonisistic actinom ycetes had m ore inhibition,and their diam eter of inhibition zone w ere:60.2mm,59.6mm,58.7mm and57.9mm, respectively.

Botrytis cinerea Pers.; antagonistic actinom yces; screening

Q815

A

1004-4639(2010)03-0219-03

2009-12-05

關麗杰(1968-),滿族,女,遼寧沈陽人,副教授,博士,主要從事植物保護產品與安全評價以及植物病理學方面的研究.