薄層色譜-分光光度法測定樟芝菌粉中的總三萜含量

張 寅,許泓瑜,陸震鳴,張曉梅,竇文芳,許正宏,＊

1江南大學醫藥學院制藥工程研究室;2江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

薄層色譜-分光光度法測定樟芝菌粉中的總三萜含量

張 寅1,許泓瑜1,陸震鳴2,張曉梅1,竇文芳1,許正宏1,2＊

1江南大學醫藥學院制藥工程研究室;2江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

采用薄層色譜(TLC)-分光光度法測定樟芝菌粉中的總三萜含量。結果表明,適宜的展開劑組成為氯仿:甲醇 =9:1。該方法排除了樟芝菌粉中含有的脂肪等物質對測定總三萜含量的干擾,其準確度明顯高于直接分光光度法和重量法,同時該方法具有較好的精密度,準確度及穩定性。

樟芝;深層發酵;三萜;薄層色譜;分光光度法

樟芝 (Antrodia cam phorata),又名牛樟菇、牛樟芝,是一種只生長于我國臺灣省牛樟樹 (Cinnam om um kanehirai)腐朽內壁的多孔菌[1〗。樟芝長久以來被用來治療食物、酒精和藥物所引起的中毒癥狀、腹瀉、腹痛、高血壓、乙型肝炎、肝癌和抗氧化等[2〗。由于樟芝自然產量十分稀少以及人工子實體栽培的不易,近年來樟芝子實體的價格十分昂貴,所以采用生物技術方法液態發酵培養樟芝菌絲體是目前最經濟、最符合環保的方法。現在臺灣市場上已經有粉末狀,膠囊,片劑形式的樟芝發酵產品[3〗。本研究中的菌粉是經過液體發酵生產得到的樟芝菌絲體[4〗。

研究表明,樟芝中的活性成分主要是三萜類化合物[5〗,因此越來越多的研究關注于樟芝三萜。目前通常采用重量法[5,6〗或比色法[7〗定量樟芝三萜類化合物,測定方法準確性并不是很好。比色法是以齊墩果酸等三萜類化合物為對照品,用香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑,利用分光光度計直接測定總三萜的含量。然而,當樣品中含有較多量的脂肪、色素等物質時,采用上述方法會產生較強的干擾,結果存在明顯的正偏差。有文獻表明,利用薄層色譜(TLC)或快速柱層析法對樣品進行預分離,可以排除其它組分對測定的干擾[8〗。本研究測定了樟芝菌粉中的脂肪含量,并采用 TLC-分光光度法測定樟芝菌粉中總三萜的含量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸(sigma,純度≥97%)。硅膠 G(青島海洋化工廠),冰醋酸、香草醛、高氯酸等均為分析純。玉米油為市售商品。

UV-2100紫外可見分光光度計 (UN I CO)、恒溫水浴鍋、電熱烘箱等。

1.2 樟芝菌粉的制備

樟芝菌種保藏于本實驗室,接種于 PDA培養基。樟芝菌粉的制備參見文獻[7〗。

1.3 樟芝菌粉中脂肪酸的分析

1.3.1 粗脂肪的提取

取樟芝菌粉 5 g,置索氏提取器中,加乙醚 100 mL,回流提取 8 h,提取液冷至室溫,過濾,收集濾液,置已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上低溫揮去溶劑,100℃干燥 1 h,移置干燥器中,冷卻 30 min,精密稱定,計算樟芝菌粉中粗脂肪含量。

1.3.2 脂肪酸的制備

稱取 0.2 mg粗脂肪,加入 0.5 mol/L的 NaOH甲醇溶液 2 mL,60℃水浴中加熱至油珠完全溶解,冷卻后加入 25%BF3甲醇溶液 2 mL,酯化 20 min,冷卻后加入 2 mL正已烷,振搖,加入 2 mL飽和NaCl溶液振搖,離心取上層有機相于一只干燥試管中并加入少量無水Na2SO4以除去微量的水,供 GCMS分析使用。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱:PEG 20 M,30 mm×0.32 mm;載氣:N21.5 mL/min;燃氣:H220 mL/min;助燃氣:O250 mL/min;程序升溫:起始溫度 180℃,保留 1 min,然后 3℃/min升溫至 210℃。檢測器溫度:260℃;進樣口溫度:230℃;進樣量:0.2μL。

1.3.4 質譜條件

采用電子轟擊方式進行離子化,EI源溫度為200℃,EI電離方式,電子能量 70 eV,加速電壓 330 KV,掃描速度 0.85 s,溶劑延遲 7 min,質譜掃描范圍 33～450 AMU。

1.4 樟芝菌粉總三萜的提取

采用 Song的方法提取樟芝菌粉三萜類化合物[5〗。取 5.0 g樟芝菌粉,加 50%乙醇 500 mL室溫浸提48 h,過濾,減壓濃縮至沒有乙醇味。剩余水相利用氯仿萃取三次。合并氯仿相,用氯仿定容至 50 mL,備用。另外相同方法制備樟芝菌粉總三萜提取液 50 mL,加入 2 g玉米油,用于考察脂肪對于三萜含量測定的干擾作用。

1.5 TLC-分光光度法測定總三萜

1.5.1 展開劑的選擇

取經活化的硅膠 G薄板,將三萜提取液點樣,在層析缸中用不同組成的展開劑展開,10%硫酸乙醇顯色,105℃加熱 10 min,考察不同組成的展開劑的分離效果。

1.5.2 三萜標準曲線的繪制

準確稱取齊敦果酸標準品 10.0 mg于 10 mL的容量瓶中,加入甲醇定容,搖勻,即為濃度 1.0 mg/ mL的標準品溶液。依次吸取 20、40、60、80、100和120μL的標準品溶液在經過活化的硅膠板上點樣,同時在點樣部分旁邊點上相同溶液作為對照樣,展開后揮干溶劑,在對照樣部分噴 10%硫酸乙醇,105℃加熱 10 min,然后刮取與紅紫色部分相對應的樣品部分的條帶,用甲醇為溶劑提取 (200 W,10 min)三次,洗脫液加入 10 mL具塞試管,水浴蒸干,加入0.3 mL的 5%香草醛-冰醋酸溶液和 1 mL高氯酸, 60℃反應 10 min,冰水冷卻,加 10 mL冰醋酸,搖勻,在 550 nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線。1.5.3 TLC-光度法測定樟芝總三萜

用微量進樣器吸取樟芝三萜提取液在經過活化的硅膠板上點樣,同時在點樣部分旁邊點上相同溶液作為對照樣,展開后揮干溶劑,在對照樣部分噴10%硫酸乙醇,105℃加熱 10 min,然后刮取與紅紫色部分相對應的樣品部分的條帶,用甲醇為溶劑超聲提取三次,洗脫液加入 10 mL具塞試管,水浴蒸干,然后按照標準曲線的測定方法測定樟芝總三萜的含量。另取相同量總三萜 +玉米油樣品用于重量法測定總三萜含量。

1.6 重量法測定總三萜

取總三萜提取液 10 mL,60℃烘干至恒重,計算總三萜含量。另取相同量總三萜 +玉米油樣品用于重量法測定總三萜含量。

1.7 直接光度法測定總三萜

取總三萜提取液 40μL于 10 mL具塞試管,水浴蒸干,加入 0.3 mL的 5%香草醛-冰醋酸溶液和 1 mL高氯酸,60℃反應 10 min,冰水冷卻,加 10 mL冰醋酸,搖勻,在 550 nm波長下測定吸光度,計算總三萜的含量。另取相同量總三萜 +玉米油樣品用于直接光度法測定總三萜含量。

1.8 TLC-光度法的評價

1.8.1 測定方法的穩定性

取 80μL齊墩果酸溶液,薄層分離、洗脫后,水浴蒸干,加 0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和 1 mL高氯酸,60℃下反應 15 min,冰水冷卻,加 5 mL冰醋酸,在 550 nm波長下測定吸光度,然后測定經過不同時間的吸光度變化。

1.8.2 測定方法的精密度

取 80μL齊墩果酸溶液 5份,薄層分離、洗脫后,水浴蒸干,分別加 0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和 1 mL高氯酸,60℃下反應 15 min,冰水冷卻,加 5 mL冰醋酸,在 550 nm波長下測定吸光度。

1.8.3 加樣回收率

準確測定樣品后加入已知量齊墩果酸進行測定,然后用差減法求出齊墩果酸的回收率。

2 結果與討論

2.1 樟芝菌粉中脂肪酸分析結果

據報道,樟芝新鮮子實體中粗脂肪含量為37.44%,子實體風干物中粗脂肪含量 為32.23%[9〗。而樟芝發酵菌絲體中粗脂肪含量也達到了 9.79%[10〗。經測定,本實驗中樟芝菌粉中總脂肪的含量為 4.69%。脂肪酸的 GC-MS分析結果見表 1。樟芝發酵粉中飽和脂肪酸相對含量為21.29%,不飽和脂肪酸相對含量為 77.77%。其中亞油酸相對含量最高,為 46.03%,其次為油酸。

測定結果表明,樟芝菌粉中含有一定量的脂肪,其在直接分光光度法測定中可能會對樟芝菌粉三萜含量的測定產生影響。

表 1 樟芝菌粉中脂肪酸的 GC-MS分析結果(以其甲酯計)Table 1 Determination of composition of fatty acid inAntrodiacam phoratain submerged culture

2.2 TLC展開劑的選擇

對不同組成和配比的 TLC展開劑進行比較后發現,氯仿∶甲醇 =9∶1的展開劑效果較好,在該條件下展開,三萜類物質(Rf為 0.2～0.8)能與脂肪酸(Rf值為 0.8～1.0)、色素等物質分離開。

2.3 標準曲線的制作

以齊敦果酸的微克數為橫坐標,吸光度為縱坐標,作圖得到標準曲線 (圖 1),其回歸方程為:Y= 0.0036X-0.0242,其中X為含量(μg),Y為吸光度,r2=0.9953。說明在 20～120μg范圍內呈良好得線性關系。

圖 1 三萜類化合物的標準曲線Fig.1 Standard curve of the triterpenoids

2.4 重量法、直接光度法和 TLC-光度法測定樟芝總三萜的比較

分別采用重量法、直接光度法和 TLC-光度法對樟芝菌粉中的三萜類化合物的含量進行測定,結果見表 2。三種方法測得的總三萜含量為 TLC-光度法＜直接光度法 ＜重量法。另外,本實驗在樟芝菌粉三萜提取液中加入 2 g玉米油用來考察脂肪對于三萜含量測定的影響。由于玉米油可以溶于氯仿,所以采用重量法測定樟芝總三萜 +玉米油中總三萜含量時,玉米油使得三萜含量明顯偏高。另外,玉米油在香草醛-冰醋酸體系中對于三萜含量的測定也具有干擾作用。本研究中的樟芝菌粉中本身含有4.69%的粗脂肪,因此樟芝中脂肪類物質對于樟芝菌粉中三萜含量測定具有不可忽視的干擾作用[8〗,而應當在測定前將及其它可能對總三萜含量測定造成干擾的物質分離除去。由此可知,T LC-光度法在直接光度法的基礎上能進一步排除脂肪、色素等干擾。

表 2 不同方法測定總三萜含量的比較Table 2 Comparison of different methods for deter mining total triterpenoids

2.5 TLC-光度法的評價

2.5.1 測定方法的穩定性

從圖 2可見,30 min內吸光度穩定,所以測定應該在顯色后 30 min內測定。

圖 2 顯色反應的穩定性Fig.2 Stability of reaction

2.5.2 測定方法的精密度

從表 2可見,連續測定 5次,其 RSD=3.64%,表明該法具有較好的精密度。

表 2 測定方法的精密度Table 2 Accuracy ofmeasurement

2.5.3 加樣回收率

從表 3可見,加樣回收率為 99.70%,RSD= 2.78%,表明加樣回收可以滿足要求。

表 3 齊敦果酸的回收率Table 3 Recovery ofmeasurement

3 結論

樟芝菌粉三萜提取物中含有脂肪、色素等物質,這些物質對于香草醛-高氯酸體系測定三萜含量具有明顯的正偏差作用,以至于在進行菌種生產能力鑒定和分析樟芝產品時產生誤差。采用薄層色譜分離,分光光度法測定樟芝菌粉中的總三萜含量,可以去除提取物中脂肪、色素等物質對于測定的干擾,從而能夠獲得較為準確的三萜含量結果。同時該方法具有簡單,操作方便,靈敏度高的特點。該法可用于樟芝原料及相關產品的質量分析。

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Determ ination of Total Triterpenoids inAntrodia cam phoratain Submerged Culture by TLC-spectrophotometryM ethod

ZHANG Yin1,XU Hong-yu1,LU Zhen-ming2,ZHANG Xiao-mei1,DOU Wen-fang1,XU Zheng-hong1,2＊

1Laboratory of Pha rm aceutical Engineering,School of M edicine and Pha rm aceutics,Jiangnan University;2The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,W uxi 214122,China

A method of thin layer chromatography(TLC)-spectrophotometry analysis of total triterpenoids inAntrodia cam phoratain submerged culturewas investigated in thispaper.The results showed that the spectrophotometry combined with the TLC waswell suitable to accurately deter minate the contentof total triterpenoids inAntrodia cam phoratain submerged culture.The accuracyof thismethodwas better than thatof the direct spectrophotometry.The recovery of the procedure was 99.70%and RSD of 2.78%(n=5).

Antrodia cam phorata;submerged culture;triterpenoids;TLC;spectrophotometry

Q946.91;R284.1;TS202.3

A

1001-6880(2010)04-0639-04

2008-12-04 接受日期:2009-03-16

教育部新世紀人才支持計劃(NCET-07-0380);國家“863”重點項目(2007AA021506)

＊通訊作者 Tel:86-510-85918206;E-mail:zhenghxu@jiangnan.edu.cn