不同海拔高度五脈綠絨蒿中槲皮素和木犀草素含量變化

張長現,葉潤蓉,盧學峰,岳鵬鵬,楊仕兵,劉文惠,彭 敏＊

1中國科學院西北高原生物研究所,西寧 810001;2中國科學院研究生院,北京 100049;3青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,西寧 810001

不同海拔高度五脈綠絨蒿中槲皮素和木犀草素含量變化

張長現1,2,3,葉潤蓉1,3,盧學峰1,3,岳鵬鵬1,2,3,楊仕兵1,2,3,劉文惠1,2,3,彭 敏1,3＊

1中國科學院西北高原生物研究所,西寧 810001;2中國科學院研究生院,北京 100049;3青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,西寧 810001

采用 HPLC法測定了青海達里加山和拉雞山地區不同海拔五脈綠絨蒿的槲皮素和木犀草素含量。達里加山樣品中槲皮素和木犀草素平均含量分別為 0.1040和 0.1299 mg/g,拉雞山樣品中分別為 0.0719和 0.2018 mg/g。結果表明,五脈綠絨蒿中槲皮素和木犀草素含量在青海達里加山地區呈現出隨海拔升高而趨于增高的明顯變化趨勢,但在拉雞山地區則呈現出先降后升的變化趨勢,其內在變化規律尚待深入探究。

海拔;五脈綠絨蒿;槲皮素;木犀草素;HPLC

罌粟科綠絨蒿屬植物五脈綠絨蒿 (M econopsis quintuplinerviaRegel)分布于我國西藏、陜西、甘肅、青海、四川等地。為使用廣泛且地位重要的藏藥材,以五脈綠絨蒿為主的藏成藥近 30種,其干燥全草即傳統的藏藥吾巴拉,具有清熱解毒、利尿、消炎、止痛的功效[1]。以往研究已初步證實五脈綠絨蒿中含有生物堿類、黃酮類、揮發油類以及其它多種化學成分[2-7]。

黃酮類化合物槲皮素和木犀草素是五脈綠絨蒿的重要活性成分,槲皮素具有明顯的降血壓、降血脂、抗腫瘤等作用[8]。木犀草素是一種很具有代表性的天然黃酮[9],屬弱酸性四羥基黃酮類化合物,在植物界分布較廣,具有很強的抗氧化活性,有關藥理及臨床實驗的結果還表明木犀草素在體內具有抗菌、抗病毒及降低血脂和膽固醇的作用[10,11]。

近年來,對五脈綠絨蒿的研究報道主要集中在化學成分的提取和分離方面,對不同海拔五脈綠絨蒿黃酮含量的變化研究未見報道。曾有學者對一些植物的次生代謝產物與海拔高度的關系進行過研究,結果表明次生代謝產物含量與海拔存在著顯著或者極顯著的相關性[12,13]。

本研究采用高效液相色譜法 (HPLC)測定達里加山和拉雞山地區不同海拔五脈綠絨蒿中槲皮素和木犀草素的含量,探討海拔與槲皮素和木犀草素含量的關系,為五脈綠絨蒿的藥材品質分析及進一步合理開發利用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent1200高效液相色譜儀 (帶 G1329A自動進樣器);Agilent G1325D紫外檢測器;Zorbax E-clipse XDB-C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm,5μm); HP Chemstations色譜工作站;XW-80A渦旋混合器(上海精科實業有限公司);MOLELEMENT元素型超純水機(上海摩勒生物科技有限公司);梅特勒萬分之一天平。

標準品:槲皮素 (quercetin)、木犀草素 (luteolin)均購于中國藥品生物制品鑒定所,批號分別為100081-200406和 111520-200504。甲醇 (色譜純), 25%鹽酸(分析純),超純水。

測定樣品于 2008年 8月上旬采于青海省循化縣達里加山和湟中縣拉雞山,經中國科學院西北高原生物研究所盧學峰副研究員鑒定為五脈綠絨蒿(M econopsis quintuplinerviaRegel)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5μm),柱溫:25℃;紫外檢測波長:320 nm;以甲醇和 0.05%乙酸水溶液作為流動相,按非線性洗脫條件:0～30 min,甲醇 35%～50%;30～47 min,甲醇 50%～90%;47～50 min,甲醇 90%～100%,進樣量:10μL,流速;1.0 mL/min,進行梯度洗脫。在該色譜條件下槲皮素和木犀草素均能被洗脫并達到基線分離(圖 1、2)。

1.3 標準溶液的配制

槲皮素標準儲備液:準確稱取槲皮素標準品0.94 mg,用甲醇定容至 10 mL,搖勻。木犀草素標準儲備液:準確稱取木犀草素標準品 1.36 mg,用甲醇定容至 10 mL,搖勻。

1.4 混合標準溶液的配制

取槲皮素、木犀草素標準儲備液各 1 mL,用甲醇定容到 5 mL,搖勻。

1.5 樣品溶液的配置

取已經干燥的五脈綠絨蒿全草,粉碎。準確稱取該樣品粉末 2 g,加入甲醇:25%鹽酸 =4:2(V:V)的混合液 50 mL,80℃水浴回流 2 h酸解,過濾蒸干,用甲醇定容到 50 mL容量瓶中,經 0.45μm的微孔濾膜過濾即得。

2 結果及分析

2.1 線性關系

將混合標準溶液按“1.2”項下的色譜條件分別進樣2、4、6、8、10μL,以相應組分的色譜峰面積(Y)對其濃度 (X,mg/L)進行線性回歸,得到線性回歸方程:Y=1954.8X-15.02,r2=0.9999;Y=6965.3X-27.01,r2=0.9999,槲皮素在 0.0376～0.188μg/mL范圍內呈良好的線性關系,木犀草素在 0.0544～0.272μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 重復性實驗

準確稱取 1號樣品粉末 2 g共 6份,按照 1.5的方法制備樣品溶液,按照 1.2的色譜條件分別進樣10μL,以槲皮素和木犀草素峰面積得到的 RSD分別為 1.57%和 1.83%。

2.3 精密度實驗

將槲皮素和木犀草素的混合標準品溶液按照上述色譜方法,連續進樣 6次,每次 10μL,槲皮素和木犀草素峰面積的 RSD分別為 0.65%和 0.54%。

2.4 加樣回收率實驗

取已知含量樣品,精密對照品儲備液槲皮素、木犀草素,同“1.5”方法制備溶液,按“1.2”項下的色譜條件對加標前后溶液進行液相色譜分析,樣品中槲皮素、木犀草素平均回收率 (n=6)為 100.15%、100.63%。結果表明該方法的回收率良好,見表 1、2。

表 1 槲皮素回收率(n=6)Table 1 Recovery of quercetin(n=6)

表 2 木犀草素回收率(n=6)Table 2 Recovery of luteolin(n=6)

2.5 樣品測定

根據 1.3.2樣品溶液的制備方法,按照本文色譜條件重復測定達里加山和拉雞山不同海拔五脈綠絨蒿樣品的槲皮素和木犀草素的含量,取平均值,結果見表 3。

由表 3可以看出,在兩個地區不同海拔的五脈綠絨蒿樣品之間槲皮素和木犀草素含量都有較大差異。在達里加山地區槲皮素平均含量為 0.1299 mg/g,變化范圍為 0.0464～0.2503 mg/g,最高為最低的 5.39倍;木犀草素平均含量為 0.104 mg/g,變化范圍為 0.0767～0.1679 mg/g,最高為最低的2.19倍。在拉雞山地區槲皮素平均含量為 0.0719 mg/g,變化范圍為 0.0418～0.1014 mg/g,最高為最低的 2.43倍;木犀草素平均含量為 0.2018 mg/g,變化范圍為 0.0882～0.4043 mg/g,最高為最低的4.58倍。

通過圖 3和圖 4可以看出,在達里加山地區槲皮素和木犀草素的含量都有隨著海拔升高而增大的趨勢,海拔 3600 m以下兩者的含量增加緩慢,從3600 m開始兩者含量增加幅度加快。采用 SPSS15. 0軟件進行相關分析表明槲皮素和木犀草素與海拔高度間有著顯著的相關性,相關系數分別為 0.813 (P≤0.05)和 0.841(P≤0.05)。

通過圖 5和圖 6可以看出,在拉雞山地區槲皮素和木犀草素含量隨著海拔的變化趨勢為:海拔3500 m以下兩者的含量隨海拔升高而降低,從 3500 m開始兩者含量隨海拔升高而增加。

3 討論

3.1 在達里加山地區五脈綠絨蒿中槲皮素與木犀草素的含量隨著海拔增高而增大,這一規律可能與光照有關。有學者對銀杏的研究表明,隨海拔的升高,大氣密度減小,太陽光光譜成分發生變化,紫外線等短波光強度增大,這些短波光抑制了銀杏葉細胞的伸長生長,銀杏體內活性氧濃度也因此大大提高,進而促進細胞壁的加厚和老化[14]。另一方面,光照強度的增大、紫外光質的增強以及日照時間的延長也同時誘導和促進了機體細胞苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)和查爾酮合成酶(CHS)活性的提高,而PAL和 CHS是植物細胞內黃酮類化合物的生物合成、代謝過程中關鍵的限速酶[15,16],其活性的提高將直接導致活性氧清除劑黃酮類化合物的大量合成[17-19],從而相對應地形成一整套生理適應機制,以抵御逆境脅迫下強輻射所造成的氧化損傷。這也可能是該地區五脈綠絨蒿中槲皮素和木犀草素含量隨海拔升高的生理機制之一。

3.2 根據拉雞山地區所采樣品的測定結果分析,卻沒有表現出明顯隨海拔升高而含量增加的相同變化趨勢。以往研究表明,不同生長期的植物體內黃酮含量會有所變化[20]。在達里加山和拉雞山兩個地區,槲皮素和木犀草素的含量隨海拔表現出不一致的規律,這可能與所采集樣品的生長年限和生育期有關。五脈綠絨蒿為多年生植物,黃酮含量隨著生長年限增加而逐漸積累,但是目前尚不能區別采集樣品的生長年限,而本實驗采用混合樣品進行測定,這可能對實驗結果造成一定影響。其次,不同海拔高度的五脈綠絨蒿處于不同的生育期,植物體內黃酮的含量也會受到影響。因此,對于五脈綠絨蒿中是否存在黃酮成分含量隨海拔而升高的規律,尚有待于進一步的深入驗證。

3.3 由于影響五脈綠絨蒿的生長發育以及體內黃酮積累的因素比較復雜,可能是多種生態因子如降雨量、土壤、溫度、紫外線輻射強度等協同作用的結果,從而影響到植物體內黃酮含量。對于影響五脈綠絨蒿次生代謝產物積累的關鍵生態環境因子,還有待于今后進一步深入研究。

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Variations on the Contents of Quercetin and Luteolin ofM econopsis quintuplinerviaRegel from D ifferent Altitudes

ZHANG Chang-xian1,2,3,YE Run-rong1,3,LU Xue-feng1,3, YUE Peng-peng1,2,3,YANG Shi-bing1,2,3,L IU Wen-hui1,2,3,PENGMin1,3＊

1Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China;2Graduate University of Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China;3Q inghai Key Laboratory of Q inghai-Tibetan Plateau B iological Resources,Xining 810001,China

The contents of quercetin and luteolin inM econopsis quintuplinerviaRegel.from Mt.Dalijia and Mt.Laji area ofQinghai province were determined by HPLC method,with the separation on a Zorbax Eclipse XDB-C18Column,and ran the mobile phase with a mixture ofmethanol and acetic acid water solution at a flow rate of 1.0 mL/min,while the ultravioletwavelengthwas320 nm.InMt.Dalijia area,themean contentsof them are 0.1040 mg/g and 0.1299 mg/g,In Mt.Laji area,they are 0.0719 mg/g and 0.2018 mg/g.Variation rules of these contents influenced by altitudes were studied and discussed in this paper.According to analytical result,the contents of quercetin and luteolin contents have evident increased trends with the rise of altitudes in QinghaiMt.Dalijia area,but it showed rise after the first lower trends inMt.Laji area.It is necessary to study and discover the internal relation of the content changes.

altitude;M econopsis quintuplinerviaRegel;quercetin;luteolin;HPLC

R284.2;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0643-05

2008-10-09 接受日期:2009-01-08

中國科學院西北高原生物研究所知識創新工程領域前沿項目(CXLY-2002-7)

＊通訊作者 Tel:86-971-6143898;E-mail:pengm@nwipb.ac.cn