單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ的性質和溶栓活性

初金鑫,蔡文娣,韓寶芹,劉萬順,陳麗梅,連 波

1濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學教學部,濰坊 261053;2中國海洋大學海洋生命學院,青島 266003

單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ的性質和溶栓活性

初金鑫1,2＊,蔡文娣1,2,韓寶芹2,劉萬順2,陳麗梅1,連 波1

1濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學教學部,濰坊 261053;2中國海洋大學海洋生命學院,青島 266003

單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ的最適反應溫度為 45℃;最適反應 pH為 7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+是該纖溶酶的強激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對該纖溶酶具有一定的抑制作用;SBTI和 PMSF,完全抑制 UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒較弱的抑制 UFE-Ⅰ。與蚓激酶類似,UFE-Ⅰ不僅具有直接的纖溶活力更具有纖溶酶原激活活力(84.0%),另外分別將蚓激酶原料與該酶加入到家兔血栓塊中,37℃孵育 3 h,結果表明該酶具有比蚓激酶更為強大的溶栓能力。

單環(huán)刺螠;纖溶酶;性質;溶栓活性

單環(huán)刺螠是黃渤海沿岸底棲生物的常見種[1],前人從蟲體中分離到了螠速激肽Ⅰ-Ⅷ、血凝集素、腺苷三磷酸酶等生物活性物質[2-6]。單環(huán)刺螠個體肥大,肉質鮮美,體壁營養(yǎng)豐富[7],2006年,王佃亮等第一次從單環(huán)刺螠體腔液和內臟中分離到了纖溶酶組分[8]。濰坊擁有中國唯一的單環(huán)刺螠種質資源保護區(qū),研究單環(huán)刺螠具有重要意義和價值,為此,濰坊醫(yī)學院生物技術實驗室較為詳細的研究了該酶的性質并初步研究其溶栓活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 單環(huán)刺螠纖溶酶 UFE-Ⅰ,中國海洋大學海洋生物活性物質實驗室制備;家兔,體重 2～2.5 kg,由濰坊醫(yī)學院實驗動物基地提供。

1.1.2 試劑與儀器:蚓激酶 (earthwor m fibrinolytic enzyme EFE),取膠囊 3粒,稱其重量為 0.658 g,用生理鹽水溶解,過 0.22μm的濾膜將不溶性白色藥物輔料去除,上清液冷凍干燥,得 0.132 g凍干酶,以尿激酶標準品標定為 1651 U/mg,青島國大藥業(yè)有限公司;注射用尿激酶 (以尿激酶標準品標定為51226 U/mg),山東綠葉制藥有限公司;尿激酶標準品 (每支含 830個單位,604-200020),中國藥品生物制品檢定所;;大豆胰蛋白酶抑制劑 (SBTI),上海三杰生物技術公司;纖溶酶原、凝血酶、纖維蛋白原、抑蛋白酶肽、糜蛋白抑制劑、對甲苯磺酰氟 (PMSF),美國 Sigma公司;苯甲脒、亮抑酶肽,Amresco公司;瓊脂糖,德國 Serva公司;其他試劑均為國產(chǎn)商品試劑分析純。AL-104電子精密天平,梅特勒-托利多儀器公司;A IR TECH超凈工作臺,安泰公司;XD-101倒置顯微鏡,南京江南光電公司。

1.1.3 家兔,由濰坊醫(yī)學院實驗動物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 酶的制備

單環(huán)刺螠體腔液經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾、離子交換層析、凝膠過濾進行分離純化,得到的單一洗脫峰酶組分,經(jīng)Native-PAGE、SDS-PAGE和飛行質譜分析,確定了 UFE-Ⅰ純度 99%以上和相對分子量為23887.23±0.28Da[9]。

1.2.2 酶活力測定

參照經(jīng)典瓊脂糖纖維蛋白平板法[10],并作適當改進。將尿激酶標準品配制成不同濃度的溶液點樣100μL于纖維蛋白平板上的牛津杯中,37℃孵育18 h后測量溶圈互相垂直的兩個直徑,以兩直徑的乘積為縱坐標,標準酶活力為橫坐標,制作標準曲線,根據(jù)標準曲線,計算UFE-Ⅰ的纖溶活力。

1.2.3 最適反應溫度的測定

將加樣后的纖維蛋白平板分別放入 25、30、35、40、45、50、55℃的恒溫箱中,pH 7.8保溫 1 h后取出,測各個溶圈的垂直直徑,找出 UFE-Ⅰ作用的最適溫度。

1.2.4 最適反應 pH的測定

采用 pH 2.6～12.0的廣泛緩沖液[11],分別制作 pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8. 5、9.0、9.5和 10.0的平板。其他條件均相同,37℃保溫 18 h后取出測各平板中溶圈的垂直直徑,以確定UFE-Ⅰ作用的最適 pH。

1.2.5 激活劑或抑制劑對酶活力的影響

采用幾種不同的金屬離子和蛋白酶抑制劑分別作用于UFE-Ⅰ,以不添加任何金屬離子或蛋白酶抑制劑時的酶活力為 100%。

1.2.6 激酶活力的測定

在 80℃加熱 30 min的纖維蛋白平板上,纖溶酶原失活,測得 UFE-Ⅰ的直接纖溶活力;而在標準平板上,該酶可能與被激活的纖溶酶原共同起作用,測得總活力,UFE-Ⅰ激酶活力 =總活力-直接纖溶活力。

1.2.7 體外溶栓活性的測定

試驗設生理鹽水空白對照組,蚓激酶 (EFE)陽性對照組,UFE-Ⅰ酶試驗組,分別用生理鹽水配制不同濃度的溶液。家兔靜脈取血,取滅菌試管 15支分別加入新鮮血液 1.0 mL,靜置待血液完全凝固,分別加入酶液 1.0 mL。每組做 3個平行樣。于 37℃保溫振搖,觀察各試管血栓的形態(tài)顏色和溶解變化。以任何一組血塊完全溶解為酶水解終點,生理鹽水漂洗血栓 3次,濾紙吸去多余水分,剩余血塊稱重。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 最適反應溫度

以瓊脂糖纖維蛋白平板法測得的單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ在 6種不同溫度 (25、30、35、40、45、50、55℃)條件下的酶活力如圖 (圖 1)所示。該酶的最適反應溫度約為 45℃。

圖 1 溫度對酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the enzyme activity

2.2 酶的最適反應 pH

以瓊脂糖纖維蛋白平板法測得的單環(huán)刺螠纖溶酶 UFE-Ⅰ在不同 pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0)條件下的酶活力如圖(圖 2)所示。從結果看,酶的最適 pH約為7.0,在 pH 6.5～7.5范圍內,酶活力都很高。

圖 2 pH對酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on the enzyme activity

2.3 激活劑或抑制劑對酶活力的影響

Mg2+、Mn2+和 Fe2+離子能夠顯著地提高 UFE-Ⅰ活力,是該酶的強激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF完全抑制UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制 UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都較弱的抑制該酶(表 1)。

表 1 不同金屬離子或抑制劑對酶活力的影響(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

表 1 不同金屬離子或抑制劑對酶活力的影響(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

2.4 激酶活力測定

0,40,80,120,160,200為稀釋后的尿激酶標準品活力單位梯度,U1,U2,U3為 0.005、0.05、0.5 mg/mL的UFE-Ⅰ溶液。得到UFE-Ⅰ纖溶活性分布見表 2。

圖 3 非加熱平板的纖溶活性Fig.3 Fibrinolytic ability of the non-heated plates

圖 4 加熱平板的纖溶活性Fig.4 Fibrinolytic ability of the heated plates

表 2 UFE-Ⅰ纖溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

表 2 UFE-Ⅰ纖溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

分布Constitute酶活力(U/mg) Fibrinolytic activity活力分布(%) Distribution of activity總活性Total activity 4672±57.3 100直接纖溶活性Direct fibrinolytic activity 748.3±23.6 16.0激酶活性Kinase activity 3924±57.3 84.0

2.5 兩種酶不同濃度下水解血栓速度的比較

酶水解血栓 3 h后,UFE-Ⅰ組 (1 mg/mL)肉眼已看不到栓塊,取出殘余血塊,觀察下圖 (圖 5)可見,UFE-Ⅰ組(1 mg/mL)溶解血栓最快;其次為 EFE組(20 mg/mL)。EFE組 (2 mg/mL)栓塊的質量出現(xiàn)增加的現(xiàn)象,可能是 EFE使栓塊膨松后吸水的結果。殘余血栓稱重結果見表(表 3)[9],表明 UFE-Ⅰ有強大的溶栓作用。

圖 5 血栓溶解實驗中殘留的血栓Fig.5 The remained rabbit thrombuses after thrombolytic test

表 3 殘余血栓的質量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

表 3 殘余血栓的質量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

組別Group劑量Dose(mg/mL)殘余栓塊質量(g) Thrombusesmass(g) Control - 0.508±0.006 UFE-Ⅰ 1 0.001±0.000＊#

＊P＜0.01,vs control;#P＜0.05,vs EFE(20 mg/mL)

3 討論

UFE-Ⅰ作為一種新型的纖溶酶具有以下的性質特點:最適反應溫度為 45℃;最適反應 pH為7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+離子能夠顯著地提高該酶活力,是 UFE-Ⅰ的強激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF均為絲氨酸蛋白酶抑制劑,完全抑制UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都是類胰蛋白酶的抑制劑,且不抑制糜蛋白酶[12],它們均較弱的抑制 UFE-Ⅰ,說明 UFE-Ⅰ有較強的類糜蛋白酶活性和較弱的類胰蛋白酶活性。作用于底物時,可能更易于作用于芳香環(huán)側鏈氨基酸的羧基肽鍵; UFE-Ⅰ主要具有纖溶酶原激活活性 (84.0%),而直接水解纖維蛋白的活性比較弱(16.0%)。

另外UFE-Ⅰ具有強大的溶解家兔栓塊的能力,強于 20倍的蚓激酶原料。海洋無脊椎動物單環(huán)刺螠資源豐富,且可望通過人工方法進行規(guī)模化養(yǎng)殖。因此,開展單環(huán)刺螠纖溶酶的研究,探討其醫(yī)用價值,不僅對開發(fā)海洋生物新藥提供新思路新資源,同時對海洋經(jīng)濟的發(fā)展也起到積極的推動作用。

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Characterization and Thrombolysis Activity of Fibrinolytic Enzyme UFE-I fromU rechis unicinctus

CHU Jin-xin1,2＊,CA IWen-di1,2,HAN Bao-qin2,L IU Wan-shun2,CHEN Li-mei1,L IAN Bo1

1Departm ent of Preclinical m edicine,W eifang M edical College,W eifang,261053,China;2College of M arine Life Sciences,Ocean University of China,Q ingdao,266003,China

The optimum temperature ofUFE-Ⅰwas about 45℃.The optimum pH was about 7.0.Itwas discovered that Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+and Pb2+ionswere inhibitors ofUFE-Ⅰ,andMg2+、Mn2+and Fe2+ionswere activators of this enzyme.SBTI(soybean trypsin inhibitor)and PMSF(pheny lmethyl sulfonylfluoride)completely inhibited UFE-Ⅰ, which indicated that the enzyme belonged to serine protease group,chymotrypsin inhibitor fractionaly inhibited UFE-Ⅰ, leupeptin、aprotinin and benzamidine inhibited UFE-Ⅰweakly.Like lumbrokinase,UFE-Ⅰcan not only directly degrade fibrin but also indirectly hydrolyze fibrin through transfor ming plasminogen into plas min(84.0%).when each enzyme and rabbit thrombuswas incubated at 37℃ for 3 h.The results showed that UFE-Ⅰhad stronger thrombolytic ability than lumbrokinase.

U rechis unicinctus;fibrinolytic enzyme;characterization;thrombolysis activity

Q503

A

1001-6880(2010)04-0661-04

2009-11-12 接受日期:2010-01-15

＊通訊作者 Tel:86-536-8462052;E-mail:jxchu_81@yahoo.com