油脂下腳料降解菌的選育

顏焱娜,楊紅武,劉仁萍,吳民熙,曾 熾,孫天瑋,吳永堯

湖南農業大學生物科學技術學院,長沙 410128

油脂下腳料降解菌的選育

顏焱娜,楊紅武,劉仁萍,吳民熙,曾 熾,孫天瑋,吳永堯＊

湖南農業大學生物科學技術學院,長沙 410128

從油污土樣等樣品分離獲得兩種高產蛋白酶的菌株,命名為M1、DB2,其酶活力分別 213.04,206.95 U/ mL。利用該兩株菌分別對大豆粕,芝麻粕,菜籽粕作為發酵基質進行了初步的降解蛋白能力比較研究,結果表明M1、DB2均能很好的降解三種粕中的粗蛋白。M1、DB2的最適生長溫度分別為 30、35℃,最適生長 pH分別為 7、8,最佳生長時間分別為 12、32 h。初步鑒定M1、DB2為芽孢桿菌屬。

大豆粕;芝麻粕;菜籽粕;蛋白酶;芽孢桿菌(Bacillissp.)M1和DB2

餅粕是利用油料作物的籽實提取油脂后的產品[1]。餅粕中含有 30%～50%的粗蛋白質,氨基酸組成較全面[2],是一種良好的蛋白資源。我國每年油脂下腳料總量在 1000萬噸以上,然而餅粕中大多含有抗營養因子,導致這種優良蛋白質資源沒有得充分利用,甚至廢棄,這無疑造成了環境污染和自然資源的極大浪費[3]。為此本項目組以大豆粕,芝麻粕,菜籽粕為基質,篩選高效降解餅粕粗蛋白的菌株,將餅粕通過生物發酵處理后,使餅粕中的各種抗原成分、抗營養因子被有效降低去除,餅粕中的蛋白質被分解成大量的植物小肽。這種無抗原的植物小肽吸收率高,可作為優良蛋白質來源[4]等,為餅粕綜合開發利用提供一定的理論和試驗依據。

1 材料與方法

高壓滅菌鍋;恒溫培養箱;HZQ-Q振蕩器;凱氏定氮裝置。

大豆粕、芝麻粕、菜籽粕為湖南金葉肥料公司提供。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制

分離純化培養基:固體肉湯培養基[5]。

初篩培養基:酪蛋白培養基[6]。

產酶發酵培養基:芝麻粕 5 g,pH 7.5的緩沖液45 mL,NaCl 0.5%;大豆粕 5 g,pH 7.5的緩沖液 45 mL,NaCl 0.5%;菜籽粕 5 g,pH 7.5的緩沖液 45 mL,NaCl 0.5%復篩培養基:芝麻粕 100 g(40目篩),pH自然,50%水;大豆粕 100 g(40目篩),pH自然,50%水;菜籽粕 100 g(40目篩),pH自然, 50%水。

涂料、瓷磚、地板、櫥柜所用板材，甚至部分高價施工輔料，隨時存在“被偷換”的可能，因此業主們常常被告誡，要經常去工地監工。但事實上，工人想偷換材料并不那么容易。比如一般電線和電纜等施工輔材上都印有品牌的標識，從暗盒處能看到，如果工人偷換，很容易被發現。

1.2.2 菌種分離純化

將土壤制成懸濁液并稀釋后,均勻涂布于固體肉湯培養基上,37℃培養 2 d,挑取單菌落并接種至斜面培養基上保存備用。

1.2.3 菌株篩選

將斜面菌株,分別接種于酪蛋白培養基平板中,放入 37℃恒溫箱,培養 48 h,比較生長菌落直徑及透明圈直徑[7]。(2)將酪蛋白培養基平板篩選的優勢菌株接種至產酶發酵培養基中,發酵 48 h后,發酵液用于冷凍離心機 6000 r/min離心 15 min,取上清液 1 mL,稀釋 20倍用福林酚法測定發酵液中的蛋白酶活力[8],選取蛋白酶活力高的菌株為復篩出發菌。

1.2.4 菌株降解三種粕能力比較

經過初篩獲得的優勢菌株分別接種 10%到復篩培養基中發酵 7天后,檢測其中的總氮含量、蛋白氮含量、非蛋白氮含量[9]。其中總氮含量的測定[8]:采用凱氏定氮法。蛋白氮含量的測定:稱取 5 g樣品加 10 mL質量分數為 6%硫酸銅溶液,靜置過夜,過濾收集沉淀,用凱氏定氮法測定蛋白氮含量(硝化時連同濾紙一起放入凱氏瓶內硝化)。

粗蛋白含量 =蛋白氮含量 ×6.25

非蛋白氮含量 =總氮含量 -蛋白氮含量

1.2.5 菌株生長特性

分別考察以下單因素對M1、DB2生物量的影響:(1)培養時間分別為 4、8、12、16、20、24、28、32、36 h;(2)培養溫度分別為 30、35、40、45、50、55℃; (3)培養基的 PH分別 4、5、6、7、8、9,從而了解該兩株菌的生長特性,其中生物量大小以發酵液在600nm吸光度大小表示。

1.2.6 菌種的初步鑒定

根據《常見細菌系統鑒定手冊》、《伯杰細菌鑒定手冊》,對篩選菌株進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 不同菌株產蛋白酶活性比較

從油污土樣等樣品中獲得 8株產蛋白酶菌株,即 T1、T2、T5、B1、M1、X1、DB2、CH1、CH3,為了進一步比較它們產蛋白酶活力,分析了該 8株菌在大豆粕,芝麻粕,菜籽粕三種產酶發酵培養基中產蛋白酶能力。結果見表 1,M1、DB2在大豆粕酶活較高,其中M1達到了213.04 U/mL,DB2達到了 206.95 U/ mL,與有關研究[9]比較,可知該兩株菌的酶活力較高,可作為良好的出發菌株。而M1、DB2在芝麻粕、菜籽粕中酶活力均只有 35 U/mL左右,酶活力不高,這可能是芝麻粕,菜籽粕中的營養成分與大豆粕不同,不利于M1、DB2的生長代謝,從而影響它們的蛋白酶表達水平。但相對于其他菌株在芝麻粕、菜籽粕中產酶能力的比較,M1、DB2仍表現為蛋白酶活較高,故選取M1、DB2兩株菌進行降解不同粕中蛋白質能力比較。

表 1 蛋白酶產生菌株在不同粕中產蛋白酶活力Table 1 Protease activity by protease producer in different oil cakes

2.2 不同菌株降解三種粕蛋白能力的比較

表 2 三種粕粗蛋白降解效果Table 2 Degradation effect of protease in the three different oil cake

將初篩得到的菌株分別接種于復篩培養基中,以未發酵粕為對照。通過分析了經降解后的三種粕中總氮的含量,蛋白氮含量,非蛋白氮含量,比較不同菌株降解這三種粕蛋白的能力,結果見表 2。可知,M1、DB2對粕蛋白質的降解顯著性高于未發酵的粕 (P＜0.05),這說明它們對三種粕都具有很好的降解能力。其中M1使大豆粕、芝麻粕、菜籽粕中的蛋白氮含量分別下降 31.0%;11.5%;29.67%。DB2分別使大豆粕、芝麻粕、菜籽粕中蛋白氮下降34.8%;16.1%;27.12%。M1,DB2兩株菌各自降解大豆粕中的蛋白質能力顯著性高于降解芝麻粕中的蛋白質 (P＜0.05)。產生這一差異的原因可能是該三種粕主要成分有差異,三種粕中粗脂肪含量依次為大豆粕 ＜菜籽粕 ＜芝麻粕,無氮浸出物含量依次為大豆粕 ＞菜籽粕 ＞芝麻粕,粗脂肪含量越低,無氮浸出物含量越高可能越有利于M1、DB2兩株菌的生長及蛋白酶的合成。

2.3 菌株的生長特性

考察了溫度、時間、pH對M1,DB2菌株的生物量影響,結果見圖 1～3。由圖可知,M1菌株最佳生長條件為溫度為 30℃,時間為 12 h,pH值為 7時; DB2菌株最佳生長條件溫度為 35℃,時間為 32 h, pH值為 8時。M1的生長速度較快,DB2的耐高溫性較強。產生這種差異可能與菌株種屬差異有關,為此對兩株菌株形態,生化生理特性進行了初步鑒定。

圖 1 溫度對菌株影響Fig.1 Effect of temperature on the strains

2.4 初步鑒定結果

根據《常見細菌系統鑒定手冊》、《伯杰細菌鑒定手冊》,對其形態及培養特征進行了初步鑒定M1,DB2為芽孢桿菌屬B acillissp.M1和DB2。

3 結語

從油污土樣等樣品分離獲得兩種高產蛋白酶的菌株 M1、DB2。其在大豆粕中酶活力分別為213.04,206.95 U/mL。M1、DB2均能很好的降解三種粕中的粗蛋白,其中兩株菌降解大豆粕中的蛋白質能力顯著性高于降解芝麻粕中的蛋白質 (P＜0.05)。

M1、DB2為產中性蛋白酶菌株,M1,DB2的最適生長溫度分別為 30、35℃,最適生長 pH分別為 7和 8,最佳生長時間分別為 12、32 h。兩株菌均為革蘭氏染色陽性菌,桿狀菌株,含有孢子,其中 DB2耐熱性較好,初步鑒定為芽孢桿菌屬。

綜上所述,M1、DB2可作為降解大豆粕粗蛋白的優良菌株,為餅粕綜合開發利用提供一定的基礎數據資料和試驗依據。

1 Xue ZC(薛志成).The rational use ofMeal in animal feed.The Anim al Feed in Hunan(湖南飼料),2005,3:28-29.

2 Xiao SP(肖世平),QiLH(漆林花).The nutritional value of rapeseed meal and hang-nutritional factor.The An im al Feed in Guangdong(廣東飼料),1995,6:11-13.

3 Wang XS(汪習生),Nuo JQ(羅繼權).Swill restaurant waste oil and waste an imal and vegetable oils is deserve to use deeply.Study on Renewable Resources(再生資源研究), 2001,3:24-26.

4 Wei L(衛琳),Song JM(宋俊梅),Huang YF(黃永鋒). Researching and applicating the Solid-state fermentation of soybean meal in animal feed.The Use of New Technologies in the Protein RawMaterial(蛋白原料應用新技術),2008, 8:12-13.

5 Du LX(杜連祥),Lu FP(路福平).Microbiology of Laboratory Technicians(微生物學實驗技術).Beijing:China Light Industry Press,2005,8(1):349-350.

6 ShaoW(邵偉),TangM(唐明),Ling L(李鈴),et al.Application of complex mutation on high-yield strain selecting for mucor racemosus.China Condim ent(中國調味品 ), 2004,12(12):14-14.

7 Jiang XR(姜錫瑞).The Manual of Enzyme Preparation(酶制劑運用手冊).Beijing:China Light Industry Press,1999, 2(1):292-297.

8 Qiu X(邱鑫),Xiao HQ(肖漢乾),Xiang TY(向天勇),et al.Screening,identification and fer mentation conditions of the crude protein-degradative strain.Am ino Acids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),2005,27(1):1-5.

9 Wu X(伍欣),Zhang XY(張曉昱),Wu L(武龍).Screening of alkaline protease producing alkalophilicBacillussp..Journal of M icrobiology(微生物學雜志),2005,25(20): 40-44.

Isolation of Stra insDegrading the Garbage of O il and Fat

YAN Yan-na,YANG Hong-wu,L IU Ren-ping,WU Min-xi,ZENG Chi,SUN Tian-wei,WU Yong-yao＊
College of B ioscience and B iotechnology,HNAU,Changsha 410128,China

Two high yield proteases-producing strains named asM1,DB2 were isolated from the Oil-contaminated soil samples.The protease activities ofM1,DB2 were 213.04,206.95 U/mL,respectively.The results showed that the content of protein in soybean meal,sesame meal,rapeseed meal has descended after fermentation with M1,DB2.The optimum temperature forM1,DB2 growth were 30,35℃,The optimum pH forM1,DB2 growthwere 7,8.The optimum time forM1,DB2 growth is 12,32 h.Theywere all identified asBacillissp.M1,Bacillissp.DB2

Soybean meal;sesame meal;rapeseed meal;protease;Bacillissp.M1,DB2

Q939.97

A

1001-6880(2010)04-0674-04

2009-03-17 接受日期:2009-07-07

湖南省中南煙草實驗站項目(08-10Aa02)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:yywu357@sohu.com