48種中藥材的多種提取方法的提取物抑制內皮細胞和癌細胞增殖的活性研究

陳 龍,劉英學,陳少鵬,陸 鑫,成 浩,宋少江,周國春＊

1沈陽藥科大學中藥學院,沈陽 110016;2中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院,廣州 510663

48種中藥材的多種提取方法的提取物抑制內皮細胞和癌細胞增殖的活性研究

陳 龍1,2,劉英學2,陳少鵬2,陸 鑫2,成 浩2,宋少江1,周國春2＊

1沈陽藥科大學中藥學院,沈陽 110016;2中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院,廣州 510663

采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、水為溶劑順序或單獨提取及熱水提取藥材,研究這些提取物對 HUVEC、Bel-7402、A549細胞增殖的抑制活性,篩選具有抑制內皮細胞和癌細胞增殖活性的藥材及其提取方法。本文所研究的 48種中藥材的不同提取方法的提取物抑制內皮細胞和癌細胞增殖的活性結果表明:41種中藥材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌細胞活性,其中對 HUVEC、Bel-7402和A549細胞增殖明顯抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的藥材分別有 22種、6種和 6種,對 3種細胞的增殖都有明顯抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的藥材有 5種。

中藥材;抑制細胞增殖;HUVEC;Bel-7402;A-549

無限制增殖是癌細胞的最基本的特點[1],而無節制激活血管生成作用是癌細胞獲得營養和氧氣實現癌癥發展及轉移的主要病理因素[1-3],因此有效抑制癌細胞增殖和阻斷腫瘤血管生成作用是抗癌的 2個主要策略。包括中草藥在內的動植物和微生物等是抗癌藥物的重要來源,目前臨床使用的許多抗癌藥物是天然產物或其類似物[4-6]。中草藥在我國有悠久的歷史,最近幾十年里我國中醫藥工作者已經將許多中草藥開發成為抗癌中草藥而用于各種癌癥治療,這些成果為中草藥在抗癌領域的研究做出了重要貢獻。

為了研究中草藥成分 (物質基礎)與藥理藥效活性之間的關系,本文對多個科屬的 48種中藥材進行了多種提取方法提取,篩選研究了這些提取物的抗癌細胞增殖及抗內皮細胞增殖的活性。本研究目的是:1)在細胞水平評價這些中藥材是否具有抗癌細胞和抗血管生成活性;2)確定它們的活性成分所在的提取部位。這項研究為我們將來從中草藥中發現抗癌活性成分并研究開發以中草藥為源頭的抗癌藥物提供實驗基礎。

1 材料

1.1 藥材

本文所用 48種中藥材(TCMs)均購自廣州市同仁堂藥業五羊店,都有明確的省縣(市)產地記錄。

1.2 細胞

激活內皮細胞增殖是血管生成的最重要的環節[2,3],本文所用的內皮細胞是人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC),HUVEC由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院周國春實驗室從新鮮人臍帶中原代分離、傳代培養,藥物篩選所用細胞為 3～8代 HUVEC;人非小細胞肺癌細胞A549來源于ATCC(http://www.atcc.org),由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院裴端卿實驗室保存;人肝癌細胞 Bel-7402購自武漢大學細胞典藏中心,由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院周國春實驗室保存。

1.3 試劑

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇或甲醇等均購自廣東省西隴化工有限公司;DMSO購自 Sigma; MTT購自 AMRESCO;RPM I-1640、DMEM/H IGH GLUCO購自 Hyclone;EG M-2購自 LONZA (cc-3162);小牛血清購自 G IBCO。

陽性藥物:A549細胞增殖陽性抑制藥物紫杉醇(Taxol)購自福建南方生物技術股份有限公司;Bel-7402細胞增殖陽性抑制藥物多柔比星 (阿霉素/ ADM)購自廣東省藥品檢驗所;HUVEC細胞增殖陽性抑制藥物 TNP470為中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院周國春實驗室合成。

1.4 儀器

粉碎機(溫嶺林大,DFT-200);旋轉蒸發儀 (廣州予華,RE-5299);低溫冷卻液循環泵 (廣州予華, DLSB-5L/25);冷凍干燥機 (廣州正儀,FD-1D-80);超級酶標儀 (美國,B IO-TEK);二氧化碳培養箱(Thermo);超凈工作臺(Thermo)。

2 方法

2.1 藥材提取方法

將藥材用粉碎機粉碎后按以下方法提取 (括號內為提取方法的縮寫,以下同此縮寫)。

順序提取:稱取 40 g粉碎藥材依次用 8倍體積量(～320 mL)溶劑石油醚(P)、二氯甲烷(D)、乙酸乙酯(E)、甲醇 (M)和水 (W)室溫浸提 3次,24 h/次,室溫減壓回收溶劑或凍干得待測樣品。

水熱提:稱取 40 g粉碎藥材用 8倍體積量 (～320 mL)水(H)100℃提取 3次,提取時間分別為 3、2和 1 h,60℃減壓蒸去大部分水后凍干得待測樣品。

單獨提取:稱取 40 g粉碎藥材單獨用 8倍體積量(～320 mL)乙醇 (N)或二氯甲烷 (d)提取 3次, 24 h/次,減壓回收溶劑得待測樣品。

2.2 活性篩選方法

2.2.1 細胞培養及藥物處理

A549和Bel-7402細胞的培養液是含 10%小牛血清的 RPM I-1640,HUVEC細胞培養液是 EG M-2 (含生長因子),細胞在 37℃,5%CO2條件下維持培養。

按A549細胞、Bel-7402細胞每孔 1500個細胞接種于 96孔板,HUVEC細胞為每孔 1000個細胞接種于 96孔板,待細胞貼壁后加入藥物 (藥物先用DMSO溶解,加藥前用 PBS稀釋),溶劑對照組和加藥組(包括陽性藥物)的細胞培養液中 DMSO終濃度均為 0.1%,每個濃度有 3個復孔。

2.2.2 MTT檢測

加藥再繼續培養 96 h后,每孔加入 20μL MTT (5.0 mg/mL),再在 37℃,5%CO2條件下繼續孵育4 h,然后吸去細胞培養液,每孔加入 100μL DMSO分析純試劑溶解 MTT被還原的產物-藍紫色For mazan結晶,并于超級酶標儀 570 nm下讀數。超級酶標儀讀數是 For mazan的吸光度值 (OD570),其反映活細胞的還原酶活力與細胞的活力成正比,因此基于溶劑對照組和加藥組吸光度值可以計算出陽性藥物(表 1)和各個提取物的 I C50(表 2)。

3 結果

3.1 藥物篩選結果

HUVEC、Bel-7402和 A-549的陽性藥物的活性見表 1。41種中藥材的多種提取物 (至少一種提取物)對 HUVEC、Bel-7402和 A-549細胞增殖有抑制活性,表 2列出了它們的活性結果 IC50,為了便于對照,我們還列舉了這些藥材文獻報道[7-9]的主要化學成分類別。

表 1 陽性藥物抑制細胞增殖的活性結果 (IC50)Table 1 Activity data(IC50)for positive compounds against corresponding cell proliferation

順序提取的所有提取物對 3種細胞都沒有抑制活性 (IC50≥50μg/mL)的藥材是:石韋 (Folium Pynosiae)、卷柏(Herba Selaginellae)、馬鞭草(HerbaVerbenae)、急性子(Sem en Im patientis)、側柏葉(Cacum en Platycladi)、牛膝(Radix Achyranthis B identatae)和赤芍(Radix Paeoniae Rubra)。

表 2 41種中藥材提取物抑制細胞增殖的活性結果 (I C50)及文獻報道的主要化學成分Table 2 Activity data(IC50)for 41 TCMs’extracts against cell proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549 and these TCMs’major constituents reported in literatures

注:a所有提取物對 3種細胞都沒有活性的藥材未列在此表中;b除指定外,所有藥材均進行了順序提取;c對 3種細胞都沒有抑制活性的系列提取物未列在此表中;d只進行指定溶劑的單獨提取;“–”表示無活性 (IC50≥50μg/mL)。Notes:aTCMs without activity against all three cells were not included in the table;ball listed TCMswere conducted by sequential extraction unless designated;cthe extractwithout any inhibitory activity to three cellswas not listed in the table;dextracted onlywith designated solvent;“–”means“I C50≥50μg/mL”.

分析上述不同提取方法的提取物的活性結果可以發現,活性成分被二氯甲烷 (D或 d)提取的幾率較大,其次是乙酸乙酯 (E)及石油醚 (P);而活性成分被大極性溶劑如甲醇 (M)、乙醇 (N)和水 (W或H)的提取效率相對較低。

3.2 對 HUVEC增殖有明顯活性 (IC50≤10μg/ mL)的中藥材共 22種

按文獻報道藥材所含的成分分類 (括號內為提取方法的縮寫):1)含有醌類結構的藥材為瞿麥(N)、紫草(P、E、D)、茜草 (D、E);2)含有黃酮及木質素類結構的藥材為仙鶴草 (P)、小薊 (N)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、雞冠花 (D)、槐米 (E、D)、蒲黃(D、P、M)、艾葉 (N)、降香 (E、H、D)、蘇木 (D、H、M、E)、一點血(D)、黃芩(D、E);3)含有酚類結構的藥材為仙鶴草(P)、矮地茶 (D)、小薊(N)、降香 (E、H、D);4)含氮類化合物的藥材為馬齒莧 (W)、馬勃(D)、一點血(D);5)菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草(P、E、D)、白及 (D、E)、茜草 (D、E);6)甾體、萜類化合物的藥材為馬齒莧 (W)、馬勃 (D)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、槐米 (E、D)、艾葉 (N)、九里香(D)、雞血藤(d)、紫草(P、E、D)、穿山龍 (E、M、D)、茜草(D、E);7)含有香豆素結構的藥材為矮地茶(D)、九里香(D)。

3.3 對 Bel-7402增殖有明顯活性 (IC50≤10μg/ mL)的中藥材共 6種

按文獻報道藥材所含的成分分類 (括號內為提取方法的縮寫):1)含有醌類結構的藥材為紫草 (P、D)、茜草(D);2)含有黃酮及木質素類結構的藥材為蒲黃 (D)、降香(H)、茜草 (D)、黃芩 (D);3)含有酚類結構的藥材為降香 (H);4)菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草 (P、D)、茜草 (D);5)甾體、萜類化合物的藥材為紫草 (P、D)、穿山龍 (E)、茜草 (D);6)含有氮類化合物的藥材為茜草(D)。

3.4 對A-549增殖有明顯活性 (I C50≤10μg/mL)的中藥材共 6種

按文獻報道藥材所含的成分分類 (括號內為提取方法的縮寫):1)含有醌類結構的藥材為紫草(P)、茜草 (D、E);2)含有黃酮及木質素類結構的藥材為蒲黃(D)、降香(E、D)、蘇木 (E)、茜草 (D、E); 3)含有酚類結構的藥材為降香 (E、D);4)是菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草 (P)、茜草 (D、E);5)甾體、萜類類化合物的藥材為紫草 (P)、穿山龍 (E、 M)、茜草(D、E)。

4 討論

本次研究共篩選了分屬于多個科屬的 48種中藥材,除 7種中藥材外其余的 41種中藥材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌細胞活性,其中有些中藥材的同一提取物對 2種或以上細胞有增殖抑制活性,對 3種細胞的增殖均有明顯抑制活性 (IC50≤10 μg/mL)的藥材有 5種。另一方面,活性篩選結果發現同一藥材不同提取方法得到的提取物活性差異很大,因此有效的提取方法和合理的分配原則可能可以將一些沒有活性的成分排除在外使得有活性的成分能夠得到富集。這些初步研究結果不僅對從中草藥中尋找抑制內皮細胞增殖和抗癌細胞增殖活性的藥物研究打下基礎,而且為將來進一步研究各種不同成分之間藥理藥效活性的相互依存、相互促進、相互拮抗等關系提供了基本實驗依據。

1 Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell, 2000,100:57-70.

2 Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications.N Engl J M ed,1971,285:1182-1186.

3 Folkman J.Angiogenesis:an organizing principle for drug discovery.Nat Rev D rug D iscov,2007,6:273-286..

4 Newman DJ.Natural products as leads to potential drugs:an old processor the new hope for drug discovery.J M ed Chem, 2008,51:2589-2599.

5 Newman DJ,Cragg G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years.J Nat Prod,2007,70:461-477.

6 Newman DJ,Cragg G M.Natural products from marine invertebrates and microbes as modulators of antitumor targets.CurrD rug Targets,2006,7:279-304.

7 Edited by Nanjing University of Chinese Medicine(南京中醫藥大學編),The Dictionary of Traditional Chinese Medicines(中藥大辭典),Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,2006.

8 Gao XM(高學敏),Xu Z M(許占民),Li Z W(李鐘文),et al.ChineseMedicines(中藥學).Beijing:People’sMedical Publishing House,2000.

9 Xiao CH(肖崇厚).Chemistry of Chinese Medicines(中藥化學).Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,1987.

CHEN Long1,2,L IU Ying-xue2,CHEN Shao-peng2,LU Xin2,CHENG Hao2,SONG Shao-jiang1,ZHOU Guo-chun2＊

1School of Traditional Chinese Materia M edica,Shenyang Pha rmaceuticalUniversity, Shenyang 110016,China;2Guangzhou Institute of B iom edicine and Health,Guangzhou 510663,China

Antiproliferative Inhibition of Endothelial Cell and Cancer Cells by D ifferent Extracts of 48 Traditional Chinese M edicines

Sequential extraction or individual extraction of 48 Traditional Chinese Medicines(TCMs)by petroleum ether,dichloromethane,ethyl acetate,methanol,ethanol,water or boilingwaterwas conducted and antiproliferative activity of these extracts againstHUVEC,Bel-7402 and A549 proliferation was assayed.The results in this report showed that 41 of 48 studied TCMs expressed antiproliferative activity to HUVEC or/and cancer cells,in which 22,6 and 6 studied TCMs exhibited good inhibition(IC50≤10μg/mL)to the proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549,respectively,and 5 studied TCMs behaved good inhibitory activity(IC50≤10μg/mL)to all three cells’proliferation.

Traditional ChineseMedicine(TCM);antiproliferative activity;HUVEC;Bel-7402;A-549

R282.7/05;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0692-05

2009-06-22 接受日期:2009-09-15

中國科學院人口健康與醫藥創新基地重要方向項目(KSCX-2-Y W-R-22);廣東省中醫藥局項目(2007202)

＊通訊作者 Tel:86-20-32290487;E-mail:zhou guochun@gibh.ac.cn