基于cdd基因敲除和嘧啶操縱子轉移的胞苷產生菌的研究

蘇 靜，鄧培生，謝希賢，陳 寧

(工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

基于cdd基因敲除和嘧啶操縱子轉移的胞苷產生菌的研究

蘇 靜，鄧培生，謝希賢，陳 寧

(工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

以大腸桿菌作為出發菌株，通過基因工程手段對其進行改造，旨在提高胞苷產量．首先，通過Red重組系統敲除了大腸桿菌MG3028基因組上的胞苷脫氨酶基因(cdd)，阻斷了胞苷的分解代謝．然后，構建了含解淀粉芽孢桿菌TS8嘧啶操縱子結構基因的重組質粒pPYR3021，并將其轉入E.coli MG3028(△cdd)．與出發菌株E.coli MG3028相比，E.coli MG3028(△cdd)的胞苷產量提高了近2倍，而尿苷產量降低了近75%，攜帶重組質粒pPYR3021的菌株胞苷產量較出發菌株提高了近6倍．

大腸桿菌；胞苷脫氨酶；嘧啶操縱子；Red重組；胞苷

胞苷是人體和動植物體內RNA的結構組成部分，在生物體內生理生化過程中起著重要的調控作用，具有多方面生理活性．同時，胞苷又是很多抗病毒、抗腫瘤和抗艾滋病藥物的良好中間體以及基因工程研究的重要原材料[1]．采用微生物發酵法生產胞苷，具有條件簡單、成本低、產率高、周期短、控制容易等優勢[2]，是大規模生產胞苷的首選技術．經過傳統誘變得到的菌株會產生大量次級突變，具有菌體生長速度慢等弱點，是目前工業生產中難以解決的問題．基因工程技術改造菌株，如基因克隆、基因敲除等，因其無次級突變、改造目的性強、實驗周期短等優勢逐漸受到人們的重視．

在大腸桿菌胞苷從頭合成途徑中，尿苷酸(UMP)合成酶系和三磷酸(CTP)胞苷合成酶系受到尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的反饋抑制，而胞苷脫氨酶使胞苷進一步反應生成尿苷[3–4]．本文為了提高胞苷產量，首先利用Red重組系統敲除了胞苷脫氨酶基因cdd，切斷胞苷進一步代謝為尿苷的分解途徑，構建了含解淀粉芽孢桿菌TS8嘧啶操縱子結構基因的重組質粒pPYR3021，此操縱子編碼UMP從頭合成途徑中的6個關鍵酶．發酵研究表明，經過這些改造后，胞苷產量有了不同程度的提高，這為進一步選育胞苷生產菌奠定了基礎．

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

Escherichia coli MG3028是本實驗室篩選得到的一株胞苷產生菌株．解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TS8是本實驗室通過誘變得到的一株胞苷產生菌，它帶有5–氟胞苷(5-FCr)和3–脫雜氮尿嘧啶(3-DUr)抗性．質粒pMU3021(含有四環素抗性基因)、pMD18-T、pKD3(含有氯霉素抗性基因)、pKD46(溫敏型復制子，含有受ParaB啟動子調控的exo、bet、gam基因，Ampr)、pCP20(同時含有氯霉素和氨芐青霉素抗性基因)由天津科技大學代謝工程研究室保存．

1.2 試劑與試劑盒

Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、質粒載體pMD18-T，TaKaRa公司；PCR引物，上海生物工程公司；1,000,bp marker，Fermentas公司；L–阿拉伯糖，北京新經科生物技術公司；DNA片段膠回收試劑盒、基因組DNA的提取試劑盒、質粒小樣快速提取試劑盒，北京博邁德公司；IPTG、X-gal、溶菌酶、氨芐青霉素及氯霉素，北京索萊寶公司；蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司；其余試劑均為國產分析純．

1.3 培養基

種子培養基：葡萄糖20,g，玉米漿50,mL，豆餅水解液20,mL，酵母膏15,g，(NH4)2SO410,g，檸檬酸三鈉0.5,g，MgSO4·7H2O,5,g，KH2PO41.5,g，FeSO4·7H2O 15 mg，VB1100 mg，蒸餾水1 000 mL．

發酵培養基：葡萄糖20,g，玉米漿5,mL，豆餅水解液25,mL，酵母膏1,g，檸檬酸三鈉2,g，MgSO4·7H2O,5,g，KH2PO4,2,g，FeSO4·7H2O,100,mg，蒸餾水1,000,mL．

SOC培養基：胰蛋白胨20,g，酵母提取物5,g，NaCl,0.5,g，KCl 2.5,mmol,，MgCl210,mmol，葡萄糖20,mmol，蒸餾水1,000,mL．

1.4 引物設計

本文所用引物：P1(5′-AAAGCCACAACGGGT TCGTAAACTGTTATCCCATTACATGATTATGAG GCAACGCC TTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3′)，P2(5′-ACCAGGAGAGGGCTGGCAAGCCGGAC A A G G C G T T C A C G C C G C A T C C G G C A C CAGGC TAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3′)，P3(5′-GCTGGATTATCAGGAAGGT-3′)，P4(5′-TAACAGGCTGAGGAACACG-3′)，P5(5′-GAGACT CGAG GGAAACGGAGGAGAAAAACAT-3′)，P6 (5′-GAGAGCGGCCGC GCTGTTGTTTTCTGCCGG TTGTC-3′)，P7(5′-GAGAGCGGCCGC GGCTATTC CGGGTACCATTCGC-3′)，P8(5′-GAGACTCGAGC GCGATCAACAAGGAATTCCAGTG-3′)，由北京博邁德公司合成．設計引物P1、P2，引物5′端56,bp(下劃線所示)與待敲除的靶基因同源，3′端23,bp與pKD3上的氯霉素基因同源，中間序列為FRT位點．以P1、P2為引物，PCR擴增出pKD3上的氯霉素基因．根據大腸桿菌MG3028 cdd基因及上下游序列設計鑒定引物P3、P4．根據解淀粉芽孢桿菌基因序列，設計引物P5、P6，PCR擴增出嘧啶操縱子序列．根據質粒pMU3021的基因序列設計引物P7、P8，擴增出質粒pMU3021上包括復制起始位點、啟動子、四環素抗性在內的結構元件．

1.5 方法

1.5.1 利用Red重組系統構建大腸桿菌cdd基因缺失株

感受態的制備[5]：將含有pKD46的大腸桿菌MG3028接種，30,℃過夜培養12,h，2%接種至100,mL的LB培養基(氨芐青霉素的質量濃度為100,μg/mL)，30,℃培養至A600為0.2～0.3時，加入L–阿拉伯糖至100,mmol/L，繼續培養至 A600為0.5～0.6，充分表達pKD46上的Exo、Bet和Gam 3個蛋白．菌體預冷至4,℃，10,000,r/min離心10,min，棄培養基，用預冷的無菌水洗滌1次，用預冷的10%甘油離心洗滌3次，用600,μL 預冷的10%甘油重懸細胞，每管50,μL分裝，存放于－80,℃冰箱待用．

氯霉素抗性基因片段的擴增：以質粒pKD3為模板，P1、P2為引物，PCR擴增出含有氯霉素抗性基因的目的片段．

氯霉素抗性基因替換擬敲除的目的基因cdd：將擴增得到的1,166,bp片段約120,ng加入上述制備好的感受態細胞中，混勻，轉入0.2,cm電擊杯中，用Bio-Rad電擊儀做電轉化[6]．電擊電壓1.8,kV，電擊時間為5～6,ms，電擊后迅速加入1,mL的SOC培養基，165,r/min、37,℃培養2,h后涂于含有氯霉素的平板(氯霉素質量濃度為34,μg/mL)上．過夜培養后用菌落PCR鑒定含氯霉素抗性基因的重組菌．

抗性基因的消除及鑒定：pCP20質粒[7–8]含有一個翻轉重組酶(FLP)基因，42,℃誘導表達的FLP重組酶可以與FRT位點結合，FRT位點自身發生同源重組，從而消除一個FRT位點及抗性基因．pCP20的復制起點為溫度敏感型，在42,℃高溫下不能復制．

將pCP20轉入氯霉素抗性克隆，37,℃復蘇2,h，在含有100,μg/mL氨芐青霉素平板上篩選轉化子．篩選的轉化子42,℃過夜培養，分別涂布于含25,μg/mL氯霉素平板和無抗性平板，挑選在無抗性平板上生長而在氯霉素平板上不生長的單菌落即為抗性基因消除的菌株．以P3、P4為引物，對氯霉素抗性消失的克隆進行PCR鑒定，PCR產物進行測序驗證．

1.5.2 質粒構建及轉化

以解淀粉芽孢桿菌TS8染色體DNA為模板，P5、P6為引物，PCR擴增出嘧啶操縱子的結構基因，同時，以P7、P8為引物擴增出質粒pMU3021上包括復制起始位點、啟動子、四環素抗性在內的部分結構元件．將純化的兩段PCR產物酶切連接起來，構建成質粒pPYR3021(圖1)，在這個質粒上，pyr基因受pMU3021質粒的啟動子的調控．

圖1 質粒pPYR3021的構建Fig.1 Construction of plasmid pPYR3021

在1.5,mL無菌離心管中加入1,μL質粒DNA和200, μL大腸桿菌MG3028(△cdd)感受態細胞，輕彈管壁混勻，冰上放置30,min．將離心管置于42,℃的恒溫水浴90,s后，快速將離心管冰浴3,min．向離心管中加入500, μL的LB液體培養基，37,℃振蕩培養1,h．取150, μL的LB液體培養基菌懸液，涂布到含50,μg/mL四環素抗性的LB平板上，37,℃恒溫培養12,h后篩選轉化子，得到重組菌株MG3028 (△cdd/ pPYR3021)．

1.5.3 菌體濃度測定

取0.2,mL待測液，加入9.8,mL,0.25,mol/L的鹽酸以溶解溶液中的碳酸鈣，搖勻，以空白培養液為參比，752型分光光度計測定A600．

1.5.4 胞苷和尿苷的測定[9]

采用HPLC測定反應生成的胞苷和尿苷．

1.5.5 菌株傳代培養[10]

從胞苷產生菌MG3028(△cdd/pPYR3021)中挑取單菌落接種于含50,μg/mL四環素的LB液體培養基中，37,℃、200 r/min過夜培養，第2天按1%的接種量接種不含四環素的LB液體培養基中，37,℃連續振蕩培養，每隔6,h轉管，間隔一定時間取樣，取得不同代數的菌液．分別取第0、20、40、60、80、100代菌株適量稀釋，涂布于空白LB平板，37,℃過夜培養，分別挑取100個單菌落到空白LB平板和含四環素的LB平板，37,℃過夜培養，計算工程菌在無四環素選擇壓力下傳代時質粒丟失率．

2 結 果

2.1 cdd基因敲除及鑒定

將擴增出的氯霉素抗性基因片段轉化到含有質粒pKD46的MG3028感受態細胞中，37,℃復蘇2,h后涂布于氯霉素抗性平板上培養約24,h．以P3、P4為引物，PCR鑒定氯霉素抗性平板上長出來的陽性轉化子．cdd基因敲除前用鑒定引物PCR擴增出的片段為1,305,bp，敲除后用鑒定引物PCR擴增出的片段為1,474,bp．結果顯示：PCR擴增的目的條帶與理論值一致，如圖2(a)所示．

圖2 cdd基因敲除鑒定結果Fig.2 Verification of cdd gene knockout

將pCP20轉入氯霉素抗性克隆，37,℃復蘇2,h，在含有100,μg/mL氨芐青霉素平板上篩選轉化子．挑選出的轉化子42,℃培養過夜后，分別涂布于氯霉素抗性平板和無抗性平板，挑選在無抗性平板上生長而在氯霉素平板上不生長的單菌落，用鑒定引物P3、P4作進一步鑒定．氯霉素抗性基因缺失后，用鑒定引物PCR擴增出的片段為544 bp．瓊脂糖凝膠電泳結果與理論值一致，如圖2(b)所示．

2.2 含嘧啶操縱子的表達載體pPYR3021的構建及轉化子篩選

以P5、P6為引物，PCR擴增出嘧啶操縱子的結構基因；同時，以P7、P8為引物擴增出質粒pMU3021上包括復制起始位點、啟動子、四環素抗性在內的結構元件．分別用限制性內切酶Xho I和Not I雙酶切兩段純化的PCR產物，然后將酶切片段連接起來，構建成質粒pPYR3021，轉化敲除了cdd基因的大腸桿菌MG3028(△cdd)．在含50,μg/mL四環素抗性的LB平板上，篩選轉化子，得到重組菌株MG3028(△cdd/ pPYR3021)．提取質粒測序，結果表明構建成功．

2.3 基因改造對菌體生長的影響

將出發菌株大腸桿菌MG3028、敲除了cdd基因的MG3028(△cdd)和含有質粒pPYR3021的MG3028 (△cdd/pPYR3021)搖瓶發酵40,h，根據發酵液不同時期的吸光度繪制生長曲線，如圖3所示．結果表明，敲除了cdd基因其生長曲線與出發菌株MG3028基本一致，它們到達對數生長期與進入穩定期的時間無明顯差別，而轉入重組質粒pPYR3021后，菌株生長周期加長，其到達對數生長期延長了2 h，且菌體濃度最高只能達到1.623，原因可能是重組質粒太大，它的存在對菌株的生長造成了一定的壓力．由此說明，敲除cdd基因對大腸桿菌MG3028的生長狀況沒有太大影響，而轉入重組質粒對菌株的生長有一定的影響．

圖3 大腸桿菌MG3028、MG3028(△cdd )、 MG3028 (△cdd/pPYR3021)的生長曲線Fig.3 Growth curve of Escherichia coli MG3028，MG3028 (△cdd)and MG3028(△cdd/pPYR3021)

2.4 敲除cdd基因和過表達嘧啶操縱子pyr基因對大腸桿菌胞苷積累的影響

將cdd基因缺失突變株MG3028(△cdd)和轉化了質粒pPYR3021的MG3028(△cdd/pPYR3021)進行搖瓶發酵實驗，同時以出發菌株大腸桿菌MG3028作為對照菌株，HPLC分析胞苷和尿苷的變化．結果如圖4所示，cdd基因缺失突變株MG3028(△cdd)胞苷產量為(0.181±0.012)g/L，較出發菌株略有提高，而尿苷產量明顯降低，說明敲除cdd基因可有效地阻斷嘧啶代謝通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶，使胞苷有所積累．轉化質粒pPYR3021后，胞苷產量由出發菌株MG3028的(0.098±0.004)g/L增加到(0.580±0.026) g/L．同時，尿苷產量也略有增加，說明過表達嘧啶操縱子基因pyr，可以顯著增強嘧啶代謝途徑，胞苷產量有所提高．

圖4 大腸桿菌MG3028、MG3028(△cdd)、MG3028 (△cdd/ pPYR3021)胞苷產量的比較Fig.4 Cytidine yield of E.coli MG3028，MG3028(△cdd)and MG3028(△cdd/pPYR3021)

2.5 含嘧啶操縱子重組質粒pPYR3021穩定性測定

工程菌株MG3028(△cdd/pPYR3021)在沒有篩選壓力下的質粒穩定性如表1所示．結果說明在沒有篩選壓力下質粒不穩定，到第100代時質粒丟失率達到了22%．

表1 質粒穩定性Tab.1 Plasmid stability

3 討 論

目前，利用發酵法生產胞苷的菌株大部分為芽孢桿菌屬，主要原因是芽孢桿菌屬的嘧啶核苷代謝通量大，相關酶基因集合成簇，反饋阻遏和反饋抑制易于解除，適合選育胞苷產生菌，但該菌是革蘭氏陽性菌，載體受體系統研究少，且有質粒不穩定的障礙，所以采用基因工程技術修飾改造枯草芽孢桿菌難度較大，相關的研究報道也較少．相比于枯草芽孢桿菌，大腸桿菌具有遺傳背景清晰、基因操作簡單和異源基因兼容性好等特點，已成為基因工程研究方面應用最廣泛的宿主菌．

基于大腸桿菌在基因工程操作方面的優勢，本文選擇大腸桿菌作為出發菌株．首先，利用Red重組系統敲除了MG3028上的胞苷脫氨酶基因(cdd)，構建出cdd基因缺失突變株，與出發菌株相比，此菌株胞苷產量提高了近2倍，尿苷降低了近75%，說明阻斷胞苷降解通路對提高胞苷濃度也是必要的．

不同于大腸桿菌的嘧啶操縱子不連續地分散在染色體上[11]，構成解淀粉芽孢桿菌嘧啶操縱子的6個結構基因是連接在一起的．解淀粉芽孢桿菌TS8是通過誘變篩選得到的一株胞苷產生菌，它帶有5-FCr和3-DUr抗性，在一定程度上解除胞苷生物合成途徑中所受反饋抑制與反饋阻遏．本文將TS8嘧啶操縱子引入大腸桿菌，以增強受體菌嘧啶代謝流通量．當把重組質粒pPYR3021轉入cdd基因缺失突變株，胞苷產量提高了近6倍，同時，尿苷也略有提高，說明過表達嘧啶操縱子基因，可以顯著增強嘧啶代謝途徑，增加胞苷產量．

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Study on Cytidine Producing Strain Based on cdd Gene Knockout and Pyrimidine Operon Transfer

SU Jing，DENG Pei-sheng，XIE Xi-xian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To enhance production of cytidine，Escherichia coli was manipulated by using genetic engineering methods. The cdd gene of Escherichia coli MG3028 was knocked out to block cytidine degradation by Red recombination system. Then the recombinant plasmid pPYR3021 containing pyrimidine operon of Bacillus amyloliquefaciens TS8 was constructed and transformed into E.coli MG3028(△cdd). Compared with original strain MG3028，knockout of the cdd gene led to the enhanced production of cytidine by nearly 2-fold，and reduced production of uridine by 75%. The production of recombinant strain harboring a plasmid pPYR3021 was improved by 6-fold.

Escherichia coli；cytidine deaminase；pyrimidine operon；Red recombination；cytidine

Q784

：A

：1672-6510(2010)05-0001-05

2010-01-20；

2010-05-17

蘇 靜（1984—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.