帶有位阻基團的釕多吡啶手性配合物與DNA鍵合及其光斷裂DNA性質的研究

蒲小華楊 頻

(1寶雞文理學院化學化工系，寶雞 721007)

(2山西大學分子科學研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

帶有位阻基團的釕多吡啶手性配合物與DNA鍵合及其光斷裂DNA性質的研究

蒲小華1楊 頻＊,2

(1寶雞文理學院化學化工系，寶雞 721007)

(2山西大學分子科學研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

合成了釕多吡啶手性配合物的對映異構體 Δ-Ru(bpy)2DMNP](ClO4)2與Λ-[Ru(bpy)2DMNP](C1O4)2(Δ-1與Λ-1，DMNP=4-咪唑并[4,5-f](1,10)-鄰菲咯啉-2-N，N 二甲基苯胺)，Δ-[Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2與 Λ-Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2(Δ-2 與 Λ-2，BOPIP=2-(4-丁氧基基苯基-)咪唑并[4,5-f](1,10)-鄰菲咯啉)，用元素分析、核磁共振及旋光儀對手性配合物結構進行了表征，通過電子吸收光譜、熒光光譜、粘度實驗對手性配合物與CT-DNA相互作用的性質進行了研究。結果表明：兩對Δ-型異構體均與CT-DNA以插入模式作用。在紫外光照下，兩對對映異構體均能使質粒pBR322DNA斷裂，但Λ-1型異構體比Δ-1型異構體斷裂DNA效率更高，說明存在立體選擇性，而Δ-2與Λ-2對DNA斷裂無明顯區別。

釕多吡啶手性配合物；CT-DNA；插入作用；光斷裂；立體選擇性

八面體過渡金屬多吡啶配合物被廣泛地研究用于DNA結構探針[1-3]、DNA分子光開關[4-6]、DNA介導的電子轉移[7-9]、DNA足跡試劑以及DNA斷裂試劑等[10-11]，而Ru（Ⅱ）多吡啶類配合物因其可以與DNA以插入模式作用，有很強的親和力，并且與DNA作用之后其光物理性質有明顯的變化，便于觀察，備受重視。

Barton等用光譜法、流體力學、熒光光譜、光物理和一維核磁等方法選用Ru(phen)32+進行了研究，認為Ru(phen)32+與DNA的相互作用存在插入和靜電結合兩種方式，但以插入結合為主，由于空間結構匹配的要求，插入方式有利于Δ-異構體，發生在DNA的大溝處，靜電結合則較有利于Λ-異構體，位于DNA的小溝處[12-13]；Norden等通過線二色譜與二維核磁證實Δ-與Λ-Ru（Ⅱ）以非插入的方式結合在DNA的小溝[14-15]。爭論焦點在于不同手性配合物與DNA的作用的位點及模式。

目前國內我們課題組在這方面也做了大量研究[16-20]，研究主要集中討論DNA與配合物的作用模式及作用位點，而為了為使配合物有效插入DNA，研究多選擇平面芳香環較大的配體，使得配體在插入時其芳香環平面與DNA堿基對緊密地堆積。但是帶有位阻基團的配體的配合物與DNA作用的研究少見，拆分后的異構體與DNA作用如何也鮮有報道，為此我們設計合成并拆分釕（Ⅱ）帶位阻基團配體的配合物[Ru(bpy)2DMNP](ClO4)2與[Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2，利用元素分析、核磁共振、旋光儀等方法對其進行了結構表征，并用電子吸收光譜、熒光光譜、粘度實驗和凝膠電泳技術等手段研究其光學異構體與DNA相互作用的性質，實驗結果為研究手性配合物與DNA作用的模式提供了依據，為研究新的光斷裂試劑提供了有用信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用試劑均為分析純，使用前未作進一步處理。小牛胸腺DNA購自上海華美生物工程公司，其濃度以 ε=6600 mol-1·L·cm-1來確定。質粒 pBR322 DNA(B.R.級)和瓊脂糖(電泳級)購自北京華美公司。配合物及小牛胸腺 DNA均用 5 mmol·L-1Tris-HCl及50 mmol·L-1NaCl(pH=7.2)緩沖液配制。電泳緩沖液為 50 mmol·L-1Tris-HC1，18 mmol·L-1NaCl(pH=8.5)；TAE 電泳緩沖液為 40 mmol·L-1Tris，20 mmol·L-1冰乙酸和 1 mmol·L-1EDTA(pH=7.4)。所有緩沖溶液均使用三次蒸餾水配制。測試所用儀器為Perkin-Elmer LS 50B熒光光譜儀；Hewlett Packard HP-8432型紫外-可見光譜儀；Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀；VarioEL III型微量元素分析儀(德國EA元素分析系統公司)；Perkin-Elmer MC 241旋光儀，1 cm樣品管；Ubbelodhe粘度測定儀；DYYIII型電泳儀；UVPGDS 8000凝膠成像。

1.2 實驗方法

吸收光譜實驗、熒光光譜、粘度實驗均參照文獻方法進行[2,3,21-22]。

凝膠電泳實驗：向eppendorf管中分別加入pBR 322DNA和配合物溶液，DNA終濃度為14 mg·L-1。在365 nm波長的紫外光下照射一定的時間，然后加入溴酚藍溶液終止反應。取一定體積的反應液在90 V電壓下進行凝膠電泳150 min，取出凝膠，用凝膠成像分析系統照相。

1.3 配合物的合成及表征

1.3.1 Δ-和 Λ-1 的合成及表征

Δ-1的制備[23]采用文獻的方法：由 Δ-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸]·12H2O 與 DMNP制備。以[Ru(bpy)2(DMNP)](ClO4)2·2H2O計算元素分析理論值(%)：C 49.85，H 3.78，N 12.76，實驗值(%)：C 50.03，H 3.33，N 12.43。1H NMR(ppm,DMSO-d6)：9.27(d，2H)，9.09(dd，4H)，8.46(t，2H)，8.35 ～8.25(m，6H)，8.14～8.09(m，4H)，7.84～7.79(m，4H)，7.57(t，2H)，7.15(d，2H)，3.27(s,6H)。旋光度：2 mg 溶于 1 mL 乙腈中測定，[α]D16=-880°。

Λ-1采用 Λ-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸]·12H2O與DMNP制備。其余操作同Δ-1，由同樣的方法得到。元素分析的實驗值(%):C 50.69，H 3.88，N 13.09。其1H NMR 譜與 Δ-[Ru(bpy)2(DMNP)](ClO4)2相似。旋光度：2 mg溶于1 mL乙腈中測定，[α]D16=+860°。

1.3.2 Δ-和 Λ-2 的合成及表征

Δ-2采用同Δ-1的方法合成。元素素分析理論值以 [Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2·2H2O 計算 (%)，C 49.22，H 3.28，N 11.77，實驗值(%)：C 50.24，H 3.45，N 10.93。1H NMR(ppm,DMSO-d6)：9.31(dd，2H)，9.10(dd，4H)，8.46(t，4H)，8.38～8.28(m，4H)，8.17～8.10(m，2H)，8.06(d，2H)，7.90 ～7.79(m，4H)，7.56(t，2H)，7.45(d，2H)，4.32(t，2H)，1.98(q,2H)，1.71(m,2H)，1.19(t，3H)。旋光度：2 mg溶于 1 mL乙腈中測定，[α]D16=-870°。

Λ-2 合成同 Λ-1。元素分析實驗值(%)：C 50.79，H 3.56，N 11.02。其1HNMR 譜 與 Δ-[Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2相似。旋光度：2 mg溶于1 mL乙腈中測定，[α]D16=+890°(見圖 1)。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

配合物的MLCT吸收峰的強度在有DNA存在時均有一定的減小，這通常被認為是插入作用的特征之一。產生減色效應的原因是DNA堿基對與插入配體間發生電子堆積，使后者π*空軌道上也有一定的電子填充，從而使MLCT躍遷的幾率減少。實驗發現，Δ-異構體和Λ-異構體與DNA作用之后吸收峰均出現紅移和減色效應。表1總結了對映體與DNA作用前后的紫外光譜變化。我們可以看出，當CDNA/CRu=5時，Δ-1和Λ-1與DNA作用之后在可見光區460 nm附近存在金屬離子的(dπ軌道)到配體(π*軌道)的電子轉移躍遷(MLCT躍遷)與在341 nm處存在π-π*躍遷(DMNP)出現明顯的紅移和減色效應，Δ-2和Λ-2在461 nm處的MLCT躍遷也有明顯的紅移和減色效應，但是這對異構體與DNA作用的吸收光譜變化僅有微小差別，這說明這對異構體與DNA結合緊密，可能與DNA以插入方式結合。

為了定量的說明配合物與DNA的結合強度，我們計算了配合物與CT-DNA作用的結合常數K，公式如下：

其中CDNA表示堿基對中DNA的濃度，表觀吸收系數 εa，εf和 ε0分別代表 Aobsd/CRu，未與 DNA 結合的釕的配合物的消光系數和完全與DNA結合的釕的配合物的消光系數，以 CDNA/(εa-εf)對 CDNA作圖，擬合得直線，K值由其斜率決定即為配合物與DNA結合的固有的結合常數。計算結果顯示Δ-異構體與DNA的結合常數大于Λ-異構體的，說明Δ-型異構體插入的比Λ-型異構體深，但是與同類配合物比較這2對異構體與DNA結合常數要小些，這主要是由于N，N-二甲基與丁氧基的存在降低了 DMNP與BOPIP的平面性，使得這對異構體與DNA的結合能力降低[24]。

表1 隨著DNA的加入配合物異構體電子吸收光譜的變化Table 1 Electronic absorption spectra changes upon addition of CT-DNA

2.2 熒光光譜

配合物與DNA插入結合時，通常引起熒光強度增強，并且增強的幅度與配合物和DNA的結合程度有關。在水溶液中，配合物1和2分別在591與593 nm處產生熒光，加入DNA后，熒光強度大大增強，表明配合物的發光基團進入一疏水環境中，被水分子猝滅較弱。因此，我們推測DMNP與BOPIP插入DNA堿基對中而受到保護[25]。圖2、圖3為Δ-異構體和Λ-異構體相對熒光強度比值與CDNA曲線。由圖可見，隨著DNA的加入，Δ-1和Λ-1的熒光分別增強 2.3和 2倍，Δ-2和 Λ-2的熒光分別增強 1.7和1.5倍，每對對映體的熒光增強強度有所差別。這表明Δ-型異構體更容易插入到B-DNA的雙螺旋中，與B-DNA有較大的親合力。Λ-型異構體也插入到B-DNA雙螺旋中，但由于空間構型的影響，使得插入不易進行。我們曾以熒光滴定的方法考察這些對映體與DNA的作用，發現相同條件下，均是Λ-型熒光增強多。于是我們配置系列溶液放置24 h再測，發現Δ-型熒光增強多。這與Λ-型與DNA結合速率快的結論一致[26-27]。

發光淬滅實驗也可用于檢測手性配合物與DNA的作用強度。在存在和不存在DNA 2種情況下，配合物的對映異構體相對發光強度(F0/F)隨淬滅劑Fe[(CN)6]4-濃度變化的淬滅曲線如圖4，圖5所示。從圖可見，在未加入DNA時，Δ-異構體和Λ-異構體的發光減弱與Fe[(CN)6]4-的濃度增加成簡單的線性關系，即符合Stern-Volmer方程；加入DNA后，曲線斜率減少，減少的程度反映了配合物與DNA的結合能力，即曲線的斜率越大，配合物與DNA的結合力越小，受保護的程度越小[28]，加入DNA后，隨著淬滅劑Fe[(CN)6]4-濃度的增加，Δ-1和Λ-1淬滅曲線的斜率接近于零，沒有很明顯的區別，表明它們都受到DNA很好的保護；而Λ-2淬滅曲線斜率大于Δ-2的斜率，這說明Δ-2與DNA結合能力強，受保護程度大，其熒光不易被淬滅。

2.3 黏度實驗

為了進一步證實光學異構體與DNA的作用方式及結合強弱，黏度實驗進行了測量。一般光物理探針作為證明結合方式的論據是必要的，但是不充分的，粘度這種對DNA長度變化比較敏感的流體力學方法是檢測溶液狀態下配合物與DNA作用模式的最有效的手段[21]。一般來講，當小分子配合物以插入模式與DNA作用時，DNA的相鄰堿基對的距離會變大以容納插入配體，因而導致DNA雙螺旋伸長，DNA溶液的粘度增加；當配合物以靜電或溝面結合等非插入模式與DNA作用時，DNA溶液的粘度無明顯變化；而以部分插入方式與DNA作用時，則可能使DNA的雙螺旋扭結，使其粘度減小。圖6為配合物的異構體對DNA相對黏度的影響。由圖知，當加入配合物的異構體時，DNA的相對黏度均增加，這是由于配合物插入到DNA堿基對之間使DNA雙螺旋增長，但是Δ-1和Λ-1黏度曲線斜率大于Δ-2和Λ-2，而每對異構體中Δ-型的黏度曲線斜率大于Λ-型的，說明配合物1與DNA插入能力強，每對異構體的Δ-型與DNA插入能力比Λ-型強。

結合前面光譜實驗結論我們判定配合物1與2與DNA以插入方式鍵合，并且Δ-異構體比Λ-異構體與DNA結合能力強。

2.4 凝膠電泳

Δ-異構體和Λ-異構體對質粒pBR322 DNA的斷裂結果可以通過凝膠電泳實驗監測。在實驗條件下配合物的異構體都能夠將完整的超螺旋型質粒pBR322 DNA(FormⅠ)切割成缺刻(FormⅡ)，用365nm的紫外光照射150 min后，隨著Δ-異構體和Λ-異構體濃度的增加，FormⅠ的量逐漸減少，FormⅡ的量逐漸增加。對配合物1，如圖7所示，當配合物的濃度為30 μmol·L-1時，泳道上有少量的拖尾或者什么也沒有，這是因為質粒DNA已經被切成了我們不能捕捉到的微小的碎片，而在同樣條件下Λ-1對DNA的斷裂效率則比Δ-1更高。這個現象同樣 發 生 在 [Ru(bpy)2(TAPTP)](PF6)2，TAPTP=4,5,9,18-tetraazaphenanthreno[9,10-b]triphenylene)。這種切割效率的不同可能是由于這對異構體在不同的結合位點與DNA作用而引起的[29]，具體原因還需要進一步實驗證明。Δ-2和Λ-2對質粒pBR322 DNA的斷裂結果如圖8所示，從圖可知，在同樣的條件下，Δ-2和Λ-2均能切割pBR322 DNA，但這一對異構體對DNA的斷裂能力相當，無明顯的選擇性。

3 結 論

成功拆分了釕配合物[Ru(bpy)2DMNP](ClO4)2與Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2，實驗結果表明，盡管增大了插入配體的空間位阻，但并不影響它們與DNA的鍵合模式的改變，只是導致配合物與DNA結合力的減小。而電子吸收光譜、熒光光譜、粘度實驗研究結果表明，Δ-型異構體與CT-DNA結合能力比Δ-型異構體強。在紫外光照下，Δ-1和 Λ-1均能使質粒pBR322 DNA斷裂，但Λ-型異構體比Δ-型異構體斷裂DNA效率更高，說明存在立體選擇性，而Δ-2與Λ-2對DNA斷裂無明顯區別。

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DNA-Binding and Photocleavage of Polypyridyl Chiral Ruthenium（Ⅱ）Complexes Containing Steric Hinderance Group

PU Xiao-Hua1YANG Pin＊,2
(1Department of Chemistry,Baoji University of Arts and Sciences,Baoji，Shaanxi 721007)
(2Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Education Ministry,Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan 030006)

Two types of chiral polypyridyl ruthenium（Ⅱ） complexes Δ-Ru(bpy)2DMNP](ClO4)2and Λ-[Ru(bpy)2DMNP](ClO4)2(Δ-1 and Λ-1，DMNP=4-(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)-N，N-dimethyl-benzenamine)，Δ-[Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2and Λ-Ru(bpy)2(BOPIP)](ClO4)2(Δ-2 and Λ-2，BOPIP=2-(4-but oxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline)，have been synthesized.Their structures have been ascertained with elemental analysis，nuclear magnetic resonance spectra and polarimeter.The characteristics of the interaction of the optical isomers with CT-DNA were examined by Ultra-Vis absorption spectra，fluorescent spectra,and viscosity measurements.Experimental data indicate that all the enantiomers of these complexes bound to DNA through an intercalative mode.Upon irradiation at 365 nm，all four complexes have been found to efficiently photocleave plasmid pBR322 DNA.However Λ-1 is more efficient than Δ-1，which demonstrates enantioselective interaction of the optical isomers with plasmid pBR322 DNA.No obvious difference was found between Δ-2 and Λ-2 on photocleaving plasmid pBR322 DNA.

polypyridyl chiral ruthenium（Ⅱ）complexes;CT-DNA;intercalative mode;photocleavage;enantioselectivity

O614.82+1

A

1001-4861(2010)09-1567-06

2010-04-12。收修改稿日期：2010-05-19。

國家自然科學基金(No.20601018)資助項目。

＊通訊聯系人。E-mail：yangpin@sxu.edu.cn

蒲小華，女，30歲，碩士，講師；研究方向：生物無機化學。