消癖湯對肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺組織PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA表達的影響

王非，吳開明，常健菲，鄭楊，高長玉，安平，宋春艷

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省中西醫結合研究所，黑龍江 哈爾濱 150090)

消癖湯是在中醫理、法、方、藥的基礎上制定的有效中藥復方制劑，是在深入研究乳腺增生病的病因、病機的基礎上，遵循中醫整體觀和辨證論治原則而確立的行之有效的中藥復方。消癖湯在大量的臨床診治中，療效頗佳，為深入探求其作用機制，本研究運用原位雜交技術觀察消癖湯對肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺組織的影響，現報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗動物

選取Wistar雌性大鼠80只，體重200g左右，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 藥品和試劑

消癖湯(柴胡、白芍、莪術、牡蠣等)、逍遙散中藥飲片(黑龍江省中醫藥學會門診部提供);苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司，批號:0402271);黃體酮(天津金耀氨基酸有限公司，批號:0408231);三苯氧胺(遼寧康泰藥業有限公司，批號:041003);增殖細胞核抗原(PCNA)、抑凋亡基因BcL－2、血管內皮生長因子(VEGF)原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗儀器

AL204型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);HH·W21·Cu600型電熱恒溫水溫箱(上海醫療器械七廠);DF205型恒溫箱(50～250℃，北京醫療設備二廠);德國萊卡RM－2135型組織切片機(德國萊卡公司);Motic BA400型顯微攝影系統(廈門麥克奧迪實業集團有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠乳腺增生模型的建立 將80只雌性大鼠，隨機分為8組:正常對照組(A組)，疾病模型組(B組)，病證結合模型組(C組)，三苯氧胺組(D組)，逍遙散組(E組)，消癖湯高劑量組(F組)，消癖湯中劑量組(G組)，消癖湯低劑量組(H組)。

造模方法:A組肌注生理鹽水0.2mL·只－1，每天1次，共30天。其他各組肌注苯甲酸雌二醇0.5mg·(kg·d)－1，連續 25d，繼而改用肌注黃體酮 4mg·(kg·d)－1，連續 5d［1］。

病證造模:將C組、D組、E組、F組、G組、H組，每組都用紗布包裹尖端的止血鉗夾鼠尾，使其與其它大鼠廝打，激怒同籠的其它大鼠，每次刺激30min，每天刺激1次，連續25d。

1.4.2 藥物干預及標本采集 造模后，A、B、C組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續30d。D組以三苯氧胺灌胃，1.8mg·kg－1。E、F、G、H 組灌胃相應濃度藥液，末次給藥后，各組大鼠禁食供水24h，取胸部第2、3對乳房的乳腺，用4%多聚甲醛/0.1MPBS(pH7.6)固定，含有1/1000 DEPC內，采用原位雜交技術測定PCNAmRNA、BcL－2mRNA和VEGFmRNA的陽性表達，操作步驟如下:(1)常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6μm。(2)玻片的處理:采用多聚賴氨酸。(3)石蠟切片經常規脫蠟至脫水。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10min以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃消化15min。0.5M TBS洗3次 ×5min。蒸餾水洗1次。(5)預雜交:濕盒的準備－干的雜交盒底部加20%甘油20mL以保持濕度。按每張切片20μL加預雜交液。恒溫箱42℃4h。吸取多余液體，不洗。(6)雜交:按每張切片20μl雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱42℃雜交過夜。(7)雜交后洗滌:揭掉蓋玻片，37℃水溫的2×SSC洗滌5min×2次;0.5×SSC洗滌15min×1次;0.2×SSC洗滌15min×1次。(8)滴加封閉液:37℃30min。甩去多余液體，不洗。(9)滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60min。0.5M TBS洗5min×4次。(10)滴加 SABC－AP:37℃30min。0.5M TBS洗 5min×4次。(11)BCIP/NBT顯色:BCIP/NBT(×20)按 1∶20的比例用 0.01M TBS(pH9.5)稀釋，混勻。顯色液加至標本上。37℃顯色30min。充分水洗。(12)必要時蘇木紅復染30s，水洗。(13)中性樹膠封片。

Motic BA400型顯微攝影系統下觀察其病理形態學變化，利用圖象采集軟件Motic images advanced 3.2采集圖像并測量、處理圖像。

1.4.3 統計學處理 運用 SPSS統計軟件，利用方差分析及t檢驗的方法，進行數據分析處理，所有數據均以(±s)表示。

2 實驗結果

由表1可見，B組、C組與A組比較，PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的陽性表達明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)。消癖湯中、高劑量組對乳腺增生大鼠乳腺組織中的PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA具有較強的抑制作用，且作用與逍遙散及三苯氧胺相似。結果見表1。

表1 大鼠乳腺組織PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表達(±s)

表1 大鼠乳腺組織PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表達(±s)

注:與 A 組比較，△P<0.05，△△P<0.01;與 B 組比較，*P<0.05，**P<0.01;與 C 組比較，●P<0.05，●●P<0.01。

組別nPCNAmRNA(平均光密度)BcL－2mRNA(平均光密度)VEGFmRNA(平均光密度)9 0.14±0.01 0.17±0.03 0.20±0.02 B組 9 0.20±0.01△△ 0.20±0.02△△ 0.24±0.02△△C組 9 0.22±0.02△△ 0.21±0.03△△ 0.23±0.02△△D組 9 0.17±0.02△△**●● 0.18±0.01*● 0.21±0.02**●E組 9 0.19±0.01△△●● 0.18±0.02*●● 0.21±0.02**●F組 9 0.17±0.02△△**●● 0.19±0.02● 0.22±0.02*G組 9 0.15±0.01**●● 0.18±0.01*●● 0.21±0.03**●H組 9 0.19±0.02△△● 0.19±0.02△ 0.23±0.01 A組△△

3 討論

增殖細胞核抗原信使核糖核酸(PCNAmRNA)是合成PCNA的信息基因。PCNA是增殖細胞合成DNA所必需的核蛋白，是真核細胞DNA合成所必需的一種36KD酸性核蛋白。PCNA存在時，DNA多聚酶δ的含量迅速增加，完成增殖細胞核內DNA的合成;缺乏時DNA多聚酶δ失活，增殖細胞不能完成DNA復制，僅能合成類似okazaki的DNA短片段。BcL－2基因屬于原位基因，是一種抑制細胞程序性死亡的細胞“存活基因”(SurvivalGene)［2］。乳腺增生病的發生與逐漸加重的過程是上皮細胞增殖過度和凋亡減弱共同作用的結果。BcL－2基因作為細胞凋亡分子機制的重要調控點，成為影響乳腺導管上皮細胞凋亡的重要因素［3］。血管內皮生長因子是一種高效的多功能多肽，最早在培養的腫瘤細胞系中發現。VEGF是重要的血管滲透性因子，它可增加毛細血管和小靜脈等微小血管對大分子的通透性。微血管通透性的增加可引起血漿蛋白滲出到血管間隙，外漏的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白而沉積，后者作為臨時性基質可支持新生血管的生長。綜上說明，以上因素與乳腺增生病的發生和發展趨勢密切相關。

本實驗原位雜交的結果顯示，與正常乳腺細胞相比較，乳腺增生細胞中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的陽性表達呈遞增趨勢，提示在乳腺組織的增生過程中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA可能起到重要作用。并且病證結合造模組PCNAmRNA、BcL－2mRNA的陽性表達高于單純病模型組，提示病證結合造模組大鼠乳腺組織中細胞的增殖更加活躍。實驗結果證實，消癖湯不同劑量對乳腺增生大鼠乳腺組織細胞中的 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA均呈抑制作用，從而推測消癖湯作用機理可能是在細胞的增殖期抑制PCNAmRNA的生成，進而抑制了S期誘導DNA的合成;降低BcL－2mRNA表達，解除BcL－2mRNA對導管上皮細胞正常凋亡機制的抑制，誘導了細胞凋亡的發生;影響VEGFmRNA的活性，抑制腺體新生血管的形成，改善腺體的微循環，逆轉乳腺腺體的增生。說明消癖湯治療肝郁型乳腺增生病具有一定的科學依據。

［1］ 黃旺全.大鼠乳腺增生模型的建立［J］.廣東醫學，2002，23(4):362－363.

［2］ Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts and protein products of bcl－2，the gene involved in human follicular lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986(83):5214.

［3］ 黃志清，闕秀，董建強，等.乳腺腫物Bcl－2表達與激素受體的相關研究［J］.診斷病理學雜志，1997，4(1):25 －27.