利用Minitab優化耐高溫淀粉酶發酵培養條件

(中南大學 資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083)

在紡織工業中，耐高溫的α-淀粉酶可以作為退漿酶將織物的漿料退漿除去，并且具有有效、經濟、環保等優點[1]。產耐高溫α-淀粉酶的菌種有許多，目前，研究和應用較多的是芽孢桿菌屬(Bacillus)[2]，常用的是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheninformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等。另外，也有關于嗜熱細菌和古菌的研究[3]，不過它們最適生長溫度較高，多為80 ℃以上，生長條件較苛刻，并不適合工業化生產的要求。因此，常溫菌株芽孢桿菌屬(Bacillus)仍然是研究的重點。本實驗室通過篩選，獲得一株產耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為Bacillus subtilis C1，并對其所產粗酶的相關性質進行了研究。現對其進行進一步研究，以確定其最優發酵條件。Minitab作為世界著名的數據分析軟件，具有強大的實驗設計(design of experiments，DOE)功能及數據管理、統計分析等功能[4]。在此，本文作者進行Plackett-Burman實驗[5]、最陡爬坡實驗[6]和 Box-Behnken等實驗[7]，并利用 Minitab軟件對Bacillus subtilis C1發酵生產的相關影響因素進行研究和探索。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

菌種由本實驗室選育。

種子培養基成分為：淀粉 1%(質量分數，下同)，蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%。

基礎發酵培養基成分為：麩皮 1%，棉粕粉 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 0.5%。

采用500 mL搖瓶盛裝200 mL培養基。

1.2 粗酶液制備

采用三角瓶(500 mL)裝培養基200 mL，接種后于45 ℃恒溫振蕩培養48 h，在4 ℃取發酵液于10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.3 酶活測定

采用Yoo改良法測定酶活[8?9]。在20 mL試管中加入5 mL 0.5%淀粉溶液(用pH=6.0磷酸鹽緩沖液新鮮配制)，在70 ℃預熱10 min。然后加入稀釋一定倍數的0.5 mL酶液，在70 ℃準確反應5 min后，加入5 mL 0.1 mol/L HCl終止反應。取0.5 mL反應液加入盛有5 mL 0.4 mmol/L I2-KI溶液的試管中顯色。在波長為620 nm處測定吸光度。酶活力單位U定義：在pH為6.0、溫度為70 ℃、于5 min水解1 mg淀粉所需的酶量。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素實驗

采用單次單因素法[10]，假設各因素間不存在交互作用，1次改變培養基的1個因素的水平而其他因素保持不變，然后逐個進行考察優化。

作為Plackett-Burman實驗的準備，此實驗用來確定最佳C源、N源、溫度和初始pH、轉速等。1.4.2 Plackett-Burman實驗設計

Plackett-Burman實驗設計(PBD)[11]被稱作篩選實驗設計，當實驗因素較多時，實驗進行不方便，且不考慮交互作用時，才會考慮使用此方法。雖然與其他方法相比，Plackett-Burman實驗設計不能區分主效應與交互作用的影響，但可以確定對結果影響顯著的因素，從而達到篩選的目的。

Plackett-Burman實驗對每個因素取2個水平來進行分析，通過比較各因素2個水平的差異與整體的差異來確定因素的顯著性。通過Plackett-Burman實驗的篩選，能避免在后期的優化實驗中由于因素數太多或部分因素不顯著而造成的實驗資源浪費。

利用Minitab軟件創建Plackett-Burman實驗，每個因素取2個水平。按照傳統的實驗方式，高水平一般為低水平的 1.0～1.5倍。在前期單因素實驗獲得結果的基礎上，本實驗選取影響較大的6個因素，即基礎發酵培養基的成分：麩皮、棉粕粉、酵母粉、NaCl以及用于穩定酶構象而使酶活增加的 CaCl2和誘導物淀粉。其他因素如溫度、初始pH、轉速等均恒定，選用變量個數N=12的Plackett-Burman設計表，另加3個虛擬變量，用于考察實驗誤差。各因素所代表參數、水平見表1，實驗設計及結果見表2。

表1 Plaekett-Burman實驗設計參數和水平Table 1 Factors levels of Plackett-Burman design

1.4.3 最陡爬坡實驗設計

響應面的擬合方程必須在緊接鄰域內才近似真實情形，在其他區域，擬合方程與被近似的方程毫無相似之處，幾乎無意義；因此，找出主要因素后，必須通過使主要因素同時朝向響應值的最大方向變化，逼近最大響應區間，找出峰值，才能建立有效響應面方程[12]。在最陡爬坡實驗中，對酶活影響不顯著的其他因素取最低水平，而影響顯著的3個因素以實驗值的變化方向為爬坡方向，根據各因素效應值與比例來確定變化步長，最快地逼近最佳值區域。

1.4.4 Box-Behnken實驗設計

Box-Behnken(BBD)實驗設計是一種常用的響應面分析法，用來評價指標和因素間的非線性關系，估計一階、二階與一階交互作用項的多項式模式，是一種有效的響應面設計法[13]。

表2 Plaekett-Burman實驗設計表及結果Table 2 Design matrix and experimental results of Plackett-Burman design

表3 Box-Behnken實驗設計表及實驗數據Table 3 Design matrix and experimental results of Box-Behnken design

結合前面實驗結果，利用Minitab軟件創建Box-Behnken實驗設計。實驗中的3個因素為麩皮、棉粕粉和淀粉，每個因素取3個水平。實驗共有15個實驗點，其中有12個析因點和3個零點。對零點實驗進行3次，以估計誤差。

Adinarayana等[14]論述了響應面法的主要原理。根據用多項式回歸分析對實驗數據進行擬合，可得到二次多項式。它是一個描述響應變量(因變量)與自變量(操作條件)關系的模型。

其中：Y為預測響應值；β0，βi，βii和βij分別為常量、一次項系數、二次項系數和交互作用系數；Xi為自變量編碼，

xi為自變量真實值；x0為試驗中心點處自變量；xΔ為自變量的變化步長。

2 結果分析

2.1 Plackett-Burman實驗結果分析

利用Minitab對Plackett-Burman實驗數據進行分析，結果如表4所示，其標準偏差為61.041 0，預測誤差平方和為268 272，回歸方程的系數R2為0.985 8；調整后R2為0.921 9。

表4 Plackett-Burman實驗設計分析結果Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment design

從單因素效應的檢驗結果可以看出：主效應中，因素A(麩皮)、B(棉粕粉)、E(淀粉)效應顯著，其P分別為0.044，0.014和0.025，均小于0.050，可以作為進一步優化的因素。其他因素對結果影響不大，在進一步研究中，取中間水平，對影響效果不進行分析。

2.2 最陡爬坡實驗結果分析

對Plackett-Burman實驗結果進行分析，發現因素A(麩皮)對酶活具有正促進作用，B(棉粕粉)、E(淀粉)對酶活具有負促進作用，適當增加A(麩皮)，減少B(棉粕粉)、E(淀粉)的量，會使酶活增加。實驗設計和結果如表5所示。

表5 最陡爬坡試驗設計結果Table 5 Design matrix and experimental results ofsteepest accent

由表5可知：第4組實驗的酶活最大。這說明最優點在第4組實驗附近。故以實驗4的條件為響應面實驗因素水平的中心點，麩皮、棉粕粉、淀粉質量分別為2.20，1.80和0.11 g，進行下一步研究。

2.3 Box-Behnken實驗結果分析

實驗數據用 Minitab進行分析，并得出回歸方程系數顯著性檢驗、方差分析結果分別如表6～7所示。

由表6可知酶活與麩皮、棉粕粉、淀粉含量的關系可用下列回歸方程來表示：Y=2 335.43+75.40X1?49.38X2?33.02X3?48.38X12?223.67X22?61.55X32?13.37X1X2?3.29X1X3?32.92X2X3(3)其標準偏差為39.964 9，預測誤差平方和為98 942.3，回歸方程的系數R2為0.971 7；R2經調整后為0.920 6。

表6 回歸方程系數顯著性檢驗Table 6 Significance test of regression coefficient

表7 回歸方程的方差分析Table 7 ANOVA for regression equation

從表6可以看出，模型方程中常數項P為0，表明該模型是顯著的。同時，模型中的參數X1，X2，X2*X2，X3*X3的P分別為0.003，0.017，0和 0.032，均小于0.050，表明這些參數也是顯著的。

失擬(Lack-of-Fit)表示模型預測值與實際值不擬合的概率，反應擬合出來的模型與實驗數據的接近程度。從表7可知：模型失擬檢驗的P為0.367，大于0.050，因此，回歸模型適合，不需對回歸議程調整。Joglekar等[15]認為：1個相關性好的回歸模型，R2不應低于0.8。從表6所示數據可得：R2為 0.971 7，調整后R2為0.920 6，這2個值高于0.900 0且較接近，表示可以使用該模型來分析響應值。

各因素間交互作用對響應的影響如圖1～3所示。可見：麩皮和棉粕粉、棉粕粉和淀粉間的交互作用對酶活的影響顯著，而麩皮和淀粉間交互對酶活影響不顯著。為了進一步驗證最佳值，對回歸方程進行分析，令一階偏導等于0，并整理得：

圖1 麩皮(X1)和棉粕粉(X2)交互作用對酶活的影響的響應曲面Fig.1 Response surface plot for interaction effects of wheat bran and cotton seed meal on enzyme activity

圖2 麩皮(X1)和淀粉(X3)交互作用篤酶活的影響的響應曲面Fig.2 Response surface plot for interaction effects of wheat bran and starch on enzyme activity

圖3 棉粕粉(X2)和淀粉(X3)交互作用對酶活的影響的響應曲面Fig.3 Response surface plot for interaction effects of cotton seed meal and starch on enzyme activity

解上述方程組，得各因素編碼分別為X1=0.80，X2= ?0.12，X3= ?0.26。代入式(3)，可得Y=2 372.86。又由各因素編碼與其真實值之間的關系，可求得當酶活為2 372 U/mL時，麩皮、棉粕粉和淀粉真實質量分別為2.16，1.98和0.10 g。為了對預測的結果進行驗證，用以上得到的最優培養基進行3次重復實驗，所得平均酶活為2 329 U/mL，與預測值(2 372 U/mL)相差 1.83%，證實了模型的有效性。酶活為優化前酶活(185.60 U/mL)的12.55倍。

3 結論

(1) 在單因素試驗的基礎上，借助 Minitab 將響應面法應用于產耐高溫 α-淀粉酶生產菌株Bacillus subtilis C1發酵培養基的優化。回歸分析結果表明：麩皮和棉粕粉、棉粕粉和淀粉間的交互作用對酶活的影響顯著。

(2) 通過對響應方程的回歸分析，得到 Bacillus subtilis C1培養基的最佳成分(200 mL)：麩皮2.16 g，棉粕粉1.98 g，酵母粉0.40 g，NaCl 1.00 g，CaCl20.40 g，淀粉0.10 g。經過實驗驗證，該營養條件下的酶活為2 329 U/mL，約是培養基優化前酶活的12.55 倍，為工業化生產提供了一定的理論依據。

[1] 蒲宗耀, 陳松, 盧濤, 等. 耐堿耐溫淀粉酶性能及退漿工藝試驗研究[J]. 紡織科技進展, 2006(1): 24?26.PU Zong-yao, CHEN Song, LU Tao, et al. Study on thermo-stable amylase desizing for cotton fabric(Ⅰ)[J]. Progress in Textile Science & Technology, 2006(1): 24?26.

[2] Sajedi R H, Manesh H N, Khajeh K, et al. A Ca-independent α-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp. KR-8104[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005,36(5/6): 666?671.

[3] Bertoldo C, Antranikian G. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria[J]. Curr Opin Chem Biol,2002, 6(2): 151?160.

[4] Basem S. Manufacturing and design for six sigma (X-FSS)[M].Michigan: University of Michigan, 2002: 15?20.

[5] Montgomery DC. Design and analysis of experiments[M]. 5th ed.New York: John Wiley & Sons, 2000: 46?51.

[6] Muralidhar R V, Chirumamila R R, Marchant R. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J].Biochem Eng, 2001, 9(1): 7?23.

[7] Ferreira S L C, Bruns R E, Ferreira H S, et al. Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 179?186.

[8] Young J Y, Juan H, Randolph T. Hatch. Comparison of α-amylase activities from different assay methods[J].Biotechnology and Bioengineering, 1987, 30(1): 147?151.

[9] 史永昶, 姜涌明. 五種 α-淀粉酶測活方法的比較研究[J]. 微生物學通報, 1996, 23(6): 371?373.SHI Yong-chang, JIANG Yong-ming. Comparision of five methods for the assaying of α amylase activity[J]. Microbiology,1996, 23(6): 371?373.

[10] Ertola R J, Giulietti A M, Castillo F J. Design, formulation and optimization of media[J]. Bioprocess Technol, 1995, 21:89?137.

[11] 錢俊青, 周文武, 匡春蘭. 響應面法優化丁酸縮水甘油酯的酶法拆分工藝[J]. 生物工程學報, 2008, 24(6): 1062?1067.QIAN Jun-qin, ZHOU Wen-wu, KUANG Chun-lan.Optimization of enzymatic resolution technique of glycidyl butyrate via response surface methodology[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2008, 24(6): 1062?1067.

[12] LI Chan, BAI Jing-hua, CAI Zhao-ling, et al. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 93(1): 27?34.

[13] BOX G E P, BEHNKEN D W. Some new three level designs for the study of quantitative variables[J]. Technometrics, 1960 (2):455?467.

[14] Adinarayana K, Ellaiah P, Srinivasulu B, et al. Response surface method of logical approach to optimize the nutritional parameters for neomyc in production by Streptomyces marinensis under solid-state fermentation[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(11): 1565?1572.

[15] Joglekar A M, May A T. Product excellence through design of experiments[J]. Cereal Foods World, 1987, 32: 857?868.